基于质谱的系统蛋白质组学（MSPP）对空肠弯曲菌多氏亚种（Campylobacter jejuni ssp. doylei）分离株进行分型

这种质谱分析流程的总体目标被称为MSPP或基于质谱的系统发育蛋白质组学，旨在对细菌进行菌株水平的亚型分类。该方法可用于解答微生物学、流行病学和卫生学领域中的关键问题。例如，可通过可视化系统发育蛋白质组学相关性来分析疫情暴发情况。

与其他分型方法相比，MSPP 每个样本的成本较低，且速度非常快。医院获得性感染问题日益重要，我们希望 MSPP 方案能够进一步扩展应用于其他细菌甚至真菌的流行病学分型。我们的 MSPP 方案可揭示菌株之间的亲缘关系，因此在特定表型（如药物耐药性甚至毒力）与特定基因型相关联的情况下，应用该方案进行预测具有重要意义。

开始此操作时，通过将 2.5 毫克 HCCA 溶解于 250 微升有机溶剂混合液（含 50% 乙腈）中，制备两管基质溶液。向其中一管加入重组人胰岛素作为内标校准物，然后加入 47.5% 双蒸水和 2.5% 三氟乙酸。接下来，从参考菌株中取米粒大小的菌落，直接涂抹于 MALDI 目标板上。

为确定校准峰的精确质量，将1微升测试标准品点加到另一位置。在每点细菌和标准品上覆盖1微升添加了基质溶液的HCCA，并于室温下静置使其结晶。针对每种待分析菌株，重复涂布制样步骤。

每个点样位置覆盖1微升掺入标准品的HCCA基质溶液，室温下静置使其结晶。或者，也可从难以裂解的细胞中提取蛋白质。具体操作为，用接种环从琼脂平板培养物上收集约5个菌落。

将菌落悬浮于1.5毫升离心管中的300微升双蒸水中，通过反复吹打充分混匀，直至细菌菌落完全悬浮。然后加入900微升无水乙醇并混匀。在13,000 g离心1分钟。

干燥沉淀后，加入50 µL 70%甲酸，通过反复吹打重悬沉淀。然后，加入50 µL乙腈并混匀。在13,000 ×g下离心2分钟，去除碎片杂质。

完成后，取1 µL上清液转移至MALDI靶板的样品位置。待样品干燥后，每点覆盖1 µL HCCA基质溶液，并于室温下静置结晶。随后，对每个样品点采集600张谱图（每100次激光为一步），进行MALDI-TOF分析。

首先，单击质谱仪配置软件中的自动执行选项卡。通过左键单击方法按钮，并从下拉菜单中选择相应方法来打开方法。接着，左键单击编辑按钮，以打开自动执行方法编辑器。

在“累积”选项卡下，将满意的拍摄次数设置为100，累加值设置为600。对于每个谱图，从列表中选择校准物峰，点击“自动分配”，然后按“确定”。在从每个点获取质谱后，通过使用谱图浏览器打开谱图，并将预期质量处的峰与不含校准物的谱图进行比较，实验测定校准峰的精确质量。检查校准峰是否未被目标生物体的任何其他生物标志物所遮挡。

根据参考菌株的基因组测序数据，将DNA序列翻译为相应的氨基酸序列，计算每种编码蛋白的理论单一同位素分子量。将文件上传或复制粘贴该蛋白序列至相应生物信息学资源面板的输入框中，计算其理论等电点和分子量。将结果复制到电子表格中，其中一列包含基因标识符，另一列包含分子量。

按计算出的分子量对行进行排序，以便于查找质量。在电子表格中插入一个额外的列，用于记录去甲基化形式的分子量，即从单一同位素分子量中减去135道尔顿。通过在基因组表格中查找实测质量，将每个主要的实测生物标志物质量与参考菌株的计算质量进行匹配。

在另一个电子表格中，记录每种生物标志物离子的质量和标识符。现在，对从收集的分离株获得的质谱进行校准，校准方法与参考菌株相同。每行对应一个分离株，在质谱中识别变异的生物标志物，将每种生物标志物的实测质量及其预测的同工型分别记录在相应的列中。

通过对计算出的分子质量与参考谱图进行比对，可鉴定出空肠弯曲菌多依莱亚种（C-Jejuni Subspecies doylei）ATCC 49349 的 MALDI-TOF 质谱图中包含 14 个单电荷生物标志物离子。在该菌株中，检测到不含甲硫氨酸的 L32、L33 以及由基因 gil152939117 编码的假定蛋白、S20 M 和 S15 M 存在不同的同工型。其余被指定为生物标志物离子的质荷比在所测试的分离株中保持不变。通过使用此处列出的引物对特定基因进行 PCR 扩增和 Sanger 测序，已确定对应于质量偏移的氨基酸替换。

此处列出了 MSPP 方案中包含的所有生物标志物离子的氨基酸序列以及检测到的等位基因同工型。基于 MLST 构建的 UPGMA 系统发育树由所检测的空肠弯曲菌多氏亚种分离株生成，结果显示每个分离株属于不同的 MLST 序列型，菌株 LMG7790 具有最长的系统发育距离。

如MLST分析所示，在对空肠弯曲菌多依尔亚种分离株进行的MSPP分析中，分离株LMG7790具有最长的系统发育蛋白质组学距离。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一天内完成。在遵循本实验步骤时，需牢记实验中所用某些物质具有毒性。

例如，乙腈可引起皮肤刺激。此外，除MSPP外，还可采用DNA测序等其他方法来分析更多参数，如耐药基因的存在情况。该技术的开发为微生物学领域的研究人员探索光遗传学铺平了道路。

观看本视频后，您应该能够充分理解微小标本病理学平台（MSPP）的工作原理及其在特定问题中的应用。请务必注意，操作高致病性病原体可能具有极高危险性，必须始终采取相应防护措施，例如使用生物安全二级（S2）实验室设备。