建立脑转移模型：通过立体定向皮层内注射对转移性定植及组织学生长模式进行标准化分析

本课题组致力于研究肿瘤细胞如何在脑内定植，以及转移性生长模式如何影响临床预后和治疗反应。首先，使用精密天平称量每只小鼠的体重，以根据其体重计算所需麻醉剂的注射体积。给予麻醉剂后，将小鼠置于预热的加热垫上，保持温度在37至38摄氏度，以维持其体温调节功能，随后涂抹眼膏以防止角膜干燥。

采用当地动物伦理委员会批准的无菌技术准备小鼠。使用含碘溶液彻底消毒头皮。通过脚趾夹捏法确认麻醉深度，然后绷紧皮肤，用无菌手术刀沿颅骨中线做一道长约3至4毫米的切口。

使用同一把手术刀，轻轻刮除骨膜以暴露颅骨表面。使用耳杆将小鼠头部固定于立体定位仪中。利用立体定位臂确定前囟位置，然后将定位臂向前移动2毫米，向右侧移动1毫米，并用外科标记笔在额叶皮层标记目标位点。

使用精密牙科钻头在标记位置小心钻穿颅骨，确保不穿透硬脑膜。用无菌镊子轻轻探查该部位，确认开孔成功。接着，通过反复吹打使肿瘤细胞悬液重新悬浮，以确保细胞均匀分布。

将3微升悬液加入10微升Hamilton注射器中，并使用合适的固定架将其置于立体定位仪上。小心地将注射器针头对准颅骨钻孔位置，确保针尖斜面朝左，以保证注射的一致性。将针头垂直插入脑组织，深度为3.5毫米。

达到所需深度后，缓慢回撤针头0.5毫米，以帮助防止细胞悬液反流，并在1分钟内缓慢注射3微升肿瘤细胞悬液。注射完成后，将针头留置原位额外2分钟，以使细胞和细胞外基质沉降并减少反流。随后小心拔出注射器，将小鼠从立体定位仪上取出。

用无菌的0.9%氯化钠溶液轻轻冲洗颅骨，并用骨蜡封闭钻孔。使用三到四个缝线缝合头皮切口，每个缝线打三个紧密的结，结应靠近伤口边缘，以促进最佳愈合。使用与指定编号相对应的合适耳孔模式对小鼠耳朵进行标记。

如有必要，再次涂抹眼膏以防止角膜在恢复期间干燥，并将小鼠放回维持在37至38摄氏度的预热加热垫上，以促进从麻醉中恢复。通过依次用蒸馏水、70%乙醇和无菌0.9%氯化钠溶液各冲洗针头和针筒三次，彻底清洁并消毒Hamilton注射器。冲洗后，将Hamilton注射器置于冰上保存，直至下次使用。

最后，在小鼠仍处于麻醉状态时皮下注射镇痛剂，以确保术后立即获得镇痛效果。恢复期间将小鼠单独饲养，时间不超过一小时，以防止清醒动物与恢复中动物相互接触造成损伤。若在监测期间观察到痛苦迹象或异常行为，应采用悬线试验评估神经功能，以检测抓握力和协调性。

将小鼠悬挂在水平金属丝上，记录其是否在60秒内到达逃生平台。健康状况不良的小鼠无法到达平台并从金属丝上掉落。安乐死后采集动物组织，通过数字组织切片评估转移灶的组织学生长模式及相关特征。

大体图像证实，在注射ECM的对照组瓣膜C小鼠中未见肿瘤生长，而在注射肿瘤细胞ECM悬液的小鼠中可见转移性病灶。注射4T1或410.4乳腺癌细胞的小鼠均表现出显著更高的转移负荷，与注射ECM的对照组相比差异显著，但两种肿瘤细胞系之间无显著差异。Kaplan-Meier生存分析显示，与注射4T1细胞的小鼠相比，注射410.4肿瘤细胞的小鼠总体生存期显著更长。

组织学分析显示，4T1 和 410.4 脑转移瘤表现出不同的生长模式，其中 4T1 呈现类似集落的生长方式，而 410.4 呈现条索状上皮浸润性生长。不恰当的立体定位注射会导致细胞悬液泄漏，从而引起颅骨和脑膜的肿瘤生长；而正确的皮层内注射则可导致实质内转移，并继发脑膜播散。我们已证实，脑转移瘤的生长模式会影响预后及神经性死亡，这支持其在指导临床决策中的相关性。

该方案对于研究晚期转移性定植特别有用，可解决与临床相关的生长动态及继发性播散等问题。与其他方法不同，立体定向模型可确保脑部特异性定植，并保留完整的系统复杂性，从而实现对肿瘤进展和治疗反应的长期研究。通过提供一个可重复且具有临床相关性的研究平台，本模型有助于理解脑部定植的机制，并探索新的治疗策略。