一种用于广泛不同哺乳动物大脑中定量细胞计数研究的比较方法

研究发现，不同哺乳动物的大脑结构可塑性可能有显著差异。因此需要系统性定量分析来揭示真相。我们对不同大脑的系统分析，可以给出类似的结果，放在系统发育的背景下。

首先，取一块20摄氏度冰箱中含有游离脑片的12孔板，取出一些切片放入装有PBS溶液的培养皿中。选择各部分并放在幻灯片上。在对切片进行组织学染色后，根据特定的神经解剖特征确定大脑的水平。

将其定义为第1到第4级，使用相同数量的40微米厚序列切片，并从每个脑层级选取三个等距的冠状切片，进行免疫组化染色。在工作站上打开Neurolucida软件，将载玻片放置在显微镜下，使用选定的细胞计数物镜。在低倍分辨率下，使用软件“描图”菜单中的自由手绘轮廓线工具勾勒皮层第二层。

沿着周边追踪，得到皮层2的长度，包括古皮层和新皮层。从标记工具栏中选择单元格计数的首选符号。计数1型细胞通过一个小型体细胞识别，体形为双极性，体形在每个关注区域的体细胞直径在3到9微米之间。

计数2型细胞由体细胞体识别，体质体具有复杂的树突状树状结构，体质直径在9至18微米之间。现在，收集来自古皮层、新皮层和大脑皮层的系统发育分析数据，这些数据是通过结合古皮层和新皮层的数据获得的。将皮层层2的周长（以毫米计）收集到轮廓测量工具栏中可见的表格文件。

在同一电子表格上，收集标记工具栏中可见的类型1和类型2单元格数量。通过为每个脑、区域和脑层级添加1型和2型细胞，计算并记录细胞总数，每层分三段，每标本共12片。利用收集到的数值，通过将单元数除以周长（毫米）来计算每个区域各区段的线性细胞密度。

通过将1型或2型细胞数除以总细胞数，再乘以100，计算出1型和2型细胞的比例。接着，使用公式计算每个标本中1型和2型细胞的百分比。利用电子表格中的平均函数，计算每个物种所考虑的四个标本中这些百分比的平均值。

利用线性细胞密度进行系统发育分析，并利用每个冠状切片中计数的总细胞来估算每个半球未成熟神经元的总数。利用电子表格上的中位函数计算每个标本所考虑的12个切片的密度中位数。以中位数作为中心衡量标准，因为每组样本较小，且部分组分布不对称。

使用Neurolucida软件中的自由轮廓工具，在体形直径上画一条垂直于主轴的线。在每个脑区每个标本中随机选取至少100个随机选取的两种类型DCX阳性细胞，以获得1型和2型细胞的体细胞直径范围。现在，用学名在记事本中列出被分析的物种。

将列表上传到网站时间树。org 并导出为 NWK 文件。在Mesquite Project Software上，上传NWK文件，整合数据，并将生成文件保存为PDF文件。

最后，在之前创建的数据表中，添加一栏，列出每个物种的脑容量。计算DCX正细胞密度的自然对数和大脑大小的自然对数。在所选的统计软件上进行统计分析并下载获取的文件。

将残差输入到数据手册的新列中，以便制作残差图。所有研究物种大脑皮层中的DCX阳性细胞均一致呈现出沿皮层2形成单层的拓扑排列，主要包括小型、单极或双极细胞，以及少量大型复杂细胞。这些细胞在缺乏Ki67表达的情况下共表达了PSAN-NCAM和DCX。

并包含一个表达NeuN的复杂细胞亚群。皮层未成熟神经元的线性密度在不同物种间差异很大。系统发育比较分析显示，月桂草类的皮层未成熟神经元密度高于真骨龙类。

观察到皮层未成熟神经元密度与脑容量之间存在显著协方差。以及皮层未成熟神经元密度与新皮层2周边之间。我们的发现可以揭示不同类型可塑性之间以及不同大脑区域之间的进化权衡。