体外 重建细菌泛素化及VCP/p97介导的清除过程

我们的研究揭示了VCP（或p97）如何作为细胞质中的防御因子，抵抗多种不同的病原体。这为VCP（或p97）在治疗应用和生物工程策略中的潜力打开了新的前景。除了常规的生物化学方法外，还采用了超分辨率显微镜、冷冻电镜（cryo EM）和冷冻电子断层扫描（cryo ET）等技术，以阐明这些宿主效应分子如何在病原体上组织并发挥其破坏作用。

首先，在含有5%二氧化碳的37摄氏度条件下，于Todd Hewitt酵母培养基中过夜培养肺炎链球菌六型血清型二菌株。将一份过夜培养物接种至十份新鲜的Todd Hewitt酵母培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，直至600纳米处的光密度达到0.4。然后将900微升肺炎链球菌培养物与600微升50%甘油混合，将甘油菌种保存于负80摄氏度。

然后将一管保存在负80摄氏度的肺炎链球菌新鲜菌种解冻，并将其完全接种至5毫升Todd Hewitt酵母培养基中。取约10的7次方个肺炎链球菌细胞。为充分洗涤细胞，将细菌重新悬浮于反应缓冲液中，并在室温下以21,000 ×g离心5分钟。

用549哺乳动物细胞裂解液重悬沉淀。然后加入纯化的泛素和1毫摩尔三磷酸腺苷，在27摄氏度下孵育混合物1至2小时。随后用含有1摩尔尿素的反应缓冲液洗涤细菌一次，再用反应缓冲液额外洗涤两次。

用1%多聚甲醛固定细菌。固定后，将细胞在含有1毫克/毫升甘氨酸的PBS中孵育15分钟，然后用PBS洗涤两次。

在反应缓冲液中将泛素与其他所需组分混合，配制反应体系。调整反应体系总体积至100至150微升。将细菌重悬于含有泛素酶的反应体系中，并在27摄氏度下孵育两小时。

用含有尿素的反应缓冲液洗涤细菌三次后，用1%多聚甲醛固定。固定后，将细胞在含有1毫克/毫升甘氨酸的PBS中孵育15分钟。然后将样品在3% BSA中于27°C孵育1小时，并用PBS洗涤两次。

将发生泛素化的细菌重悬于一抗溶液中，该溶液的浓度应高于免疫荧光实验中通常使用的浓度，然后在27摄氏度下孵育一小时。用PBS洗涤细菌两次后，将其重悬于与Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555偶联的相应二抗溶液中。

现在将约10至20微升标记的细菌样品滴加到载玻片上，并加入5至10微升封片剂，可含或不含DAPI。将盖玻片覆盖在样品上，并用纸巾吸去多余的液体。将6 µM的VCP p97与1 µM的NPLOC4和1 µM的UFD-1混合。

用反应缓冲液将反应体系体积调整至约 90 微升，并在冰上孵育两小时。接着，向含有 p97 UFD-1 和 NPLOC4 的反应体系中加入 1 至 2 毫摩尔的三磷酸腺苷。然后将此混合物与 10 的 7 次方个泛素化的肺炎链球菌细胞混合，在 37 摄氏度下孵育两小时。

处理后立即从反应混合物中取出10微升等分试样，进行系列稀释。将每个稀释度的10至20微升滴加到脑心浸液琼脂平板上。在0小时至2小时的时间点之间评估菌落形成单位。

通过将两小时的菌落形成单位（CFU）计数除以零小时的CFU计数，再乘以100，计算细菌存活率百分比。当肺炎链球菌经哺乳动物细胞裂解液或重建的E-1、E-2、E-3酶系统处理时，观察到显著的泛素化现象。对照组中未检测到泛素化信号，而经OTUB1处理后，泛素化的肺炎链球菌信号明显减弱，证实为K48连接的多聚泛素修饰。

线剖面分析显示泛素信号与细菌信号完全重叠，证实了二者在空间上的共定位。三维重建结果进一步确认了泛素与肺炎链球菌信号的空间重叠。野生型p97在与其辅因子UFD1和NPLOC4联合作用时，无论泛素化反应是使用细胞裂解液还是纯化的酶系统进行，在两小时后均可将细菌存活率降低至10%至20%。

当省略泛素化、p97 经加热失活或使用催化失活的 p97 E578Q 突变体时，未观察到细菌活力的降低，这证实泛素化和有活性的 p97 对细菌杀伤均是必需的。本研究揭示了宿主 E3 泛素连接酶如何修饰不同病原体，并为探究清除感染性威胁的效应机制提供了新思路。接下来，我们旨在进一步探索 p97 或 VCP 的调控机制，并对其加以改造以增强其抗菌活性。