使用FACS从鼠脑皮层组织中分离周细胞用于单细胞测序

我们的研究聚焦于脑部寄生虫，重点关注其在神经血管单元中的血管功能及其相互作用，以理解大脑功能。通过低成像和空间FACS技术对肠道过程进行图谱绘制，或揭示寄生虫在脑血管系统中的功能，从而发现特定位置的作用机制及治疗靶点。首先，用75%乙醇喷洒已实施安乐死的小鼠的头部和颈部区域。

使用手术刀，从枕部至额部做一条正中头皮切口，以暴露颅骨。在双侧眼眶前方做一横向切口，随后沿小脑下缘做两侧切口，以分离颅底。从后向前沿矢状缝纵向切开颅骨。

将颅骨瓣与硬脑膜一同抬起，以暴露脑组织。使用手术剪轻轻抬起脑组织，同时切断视神经和延髓与脊髓的连接。将完整的脑组织轻柔地放入含有10毫升冰冻PBS的10厘米培养皿中，避免造成任何损伤。

将脑组织转移至铝箔上。暴露蛛网膜下腔。用镊子去除硬脑膜后，用Hank's平衡盐溶液冲洗。

将组织转移至滤纸上，通过滚动去除软脑膜。用剃刀片切去并弃除嗅球及最尾端的部分，将脑组织冠状切片为厚度两到三毫米的切片。沿胼胝体分离大脑皮层。

将皮质组织转移至含有3 mL冰上预冷的组织收集缓冲液的安瓿瓶中。使用外科手术刀片将组织和安瓿瓶中的组织切碎成约1 mm × 1 mm大小的碎片，并在5分钟内完成切碎操作以保持组织的新鲜度。移液器吸头使用前需用组织收集缓冲液预润洗。

然后将移液管垂直放置，缓慢吸取剪碎的组织碎片至吸头尖端。轻柔地将碎片排入预冷的15毫升离心管中。用含2%FBS的PBS缓冲液清洗原始安瓿瓶。

将洗涤液转移至相同的离心管中，在4°C条件下以300G离心5分钟。离心后弃去上清液。将每个沉淀重悬于3 mL CD酶工作液中。

将悬液等分至三个试管中，每管加入适量的额外酶溶液，使每管终体积达到5毫升。将试管置于杂交炉中，37摄氏度、100G轨道振荡条件下孵育100分钟。孵育期间，向10毫升含2% FBS的PBS溶液中加入1毫升DNase I溶液。

在4°C条件下以300G离心5分钟以终止消化反应。然后将每个沉淀重悬于1毫升组织解离溶液中。用移液器吹打溶液100次，以促进机械解离。

接下来，将所有悬浮液合并至一个50毫升离心管中。用2毫升缓冲液冲洗每个管子，并将洗涤液合并。在4°C、300×g条件下离心5分钟，弃去最上层液体后，加入12.5毫升20% BSA，颠倒混匀。

在4°C条件下以1000 G离心20分钟。收集底部沉淀，并将上清液转移至新的50毫升离心管中。再次离心前需轻轻重悬沉淀。

将每个沉淀重悬于2毫升含2% FBS的PBS中。然后将两种悬液合并至同一管中。在4°C条件下，以300 × g离心5分钟。

弃去上清液后，将最终沉淀物重悬于含有2% FBS的2毫升PBS中。准备四个15毫升离心管，每管中含有4毫升22% percoll溶液。将0.5毫升细胞悬液轻柔地分层加至各梯度溶液上，于4°C下以560 × g离心10分钟。

吸去上清液后，将每个沉淀物重悬于1毫升HBSS BSA葡萄糖缓冲液中。然后将悬液转移至新的15毫升离心管中。用2毫升缓冲液冲洗Percoll管，并将洗涤液合并，于4°C、300×g离心5分钟。

进行流式细胞术时，吸除上清液后，将沉淀物重悬于1毫升HBSS BSA葡萄糖缓冲液中。加入5 µL Fc受体阻断试剂，在4°C孵育5分钟。然后向悬液中加入荧光标记的抗体，再进行孵育。

用六毫升 HBSS BSA 葡萄糖缓冲液洗涤细胞。然后在 4°C 条件下以 300 × g 离心五分钟。吸除上清液后，将沉淀物重悬于一毫升缓冲液中。

加入200微升七氨基放线菌素D溶液，冰上孵育10分钟。然后用添加了BSA和葡萄糖的HBSS缓冲液将终体积调至2毫升。用1% BSA溶液冲洗分选收集管的内表面。

吸出多余的溶液，每管中恰好留下一毫升溶液。将试管置于冰上，以接收分选的细胞。从脑组织中解离的细胞在流式分选过程中，依次根据前向散射面积和侧向散射面积进行设门，以排除细胞碎片。

排除CD45阳性与CD41阳性的双阳性事件，以去除造血细胞和血小板污染。富集CD13阳性的血管壁细胞。并通过七氨基放线菌素D阴性设门排除凋亡细胞，随后通过CD31阴性筛选分离寄生虫。

流式细胞术分选结果显示，有核细胞占所有事件的59.8%。CD13阳性细胞占所有事件的1%。最终的CD13阳性CD31阴性寄生细胞群体占所有事件的0.7%。

对分选细胞进行UMAP降维分析揭示了六个明显的主要簇群，表明分离细胞群体中存在细胞异质性。经Z分数标准化的热图分析显示，寄生虫标志基因在第0至第3簇群中高度且主要表达。簇群比例分析表明，第0至第3簇群占总群体的87.1%。

平滑肌细胞标志物在第四群集中富集，比例为10.14%，成纤维细胞标志物在第五群集中富集，比例为2.77%。本方案可使研究人员分离出高纯度的可穿戴寄生虫，适用于后续的单细胞测序和功能分析。主要挑战在于缺乏高度特异性的寄生虫标志物、分离过程复杂，以及污染风险增加。未来的研究可聚焦于鉴定寄生虫特异性标志物，从而实现更优的分离、更深入的功能表征以及靶向治疗研究。