利用荧光示踪剂评估小鼠牙龈上皮屏障功能

这是一种用于定量评估牙龈上皮屏障完整性的标准化方案。该方案适用于研究牙龈屏障功能障碍相关疾病以及测试促进牙龈屏障修复的药物。首先，将雄性野生型 C57BL/6J 小鼠分为三组：未处理对照组、结扎诱导牙周炎组和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）诱导牙周炎组。

选择光谱不重叠的荧光示踪剂，例如 FITC 标记的葡聚糖和罗丹明 B 标记的葡聚糖。为稀释示踪剂，将每升含 1 克 FD40 和 1 克 RD70 的溶液与 2% 羧甲基纤维素凝胶混合。将配制好的混合物置于冰上保存。

通过脚趾夹捏反射确认麻醉深度后，使用口腔撑开器保持麻醉小鼠的口腔张开。将50微升制备好的示踪剂混合物涂抹于磨牙区的唇侧牙龈表面。保持混合物作用30分钟，若被吞咽则需重新涂抹。

示踪剂作用30分钟后，将小鼠仰卧固定在纸板上，并用胶带固定四肢以 immobilize 动物。接着，打开已处死小鼠的口腔，分离上颌骨。轻轻清除周围组织，并用PBS彻底冲洗标本。

将分离的上颌骨置于载玻片上。然后在两侧放置塑形粘土，以稳定并固定盖玻片覆盖样本。小心地将解剖好的上颌骨放置在定制设计的样品托上，以确保成像时位置稳定。

使用配备25倍水浸物镜的直立单光子显微镜。聚焦于上颌骨下方的安装支撑区域并采集图像。在上颌骨内第二磨牙的颊侧表面选择感兴趣区域，并立即开始成像。

以1微米的步长从牙龈表面开始获取Z轴层扫图像，深度达到100至200微米，用于三维重建。在软件中，点击“文件”，选择“新建文件夹”以创建一个用于存储数据集的新文件夹，并为其指定一个描述性名称。在采集选项卡下，将XY格式设置为512×512，分辨率为每像素0.99微米。

然后将缩放倍数设置为1。接着将激发波长设置为488纳米和561纳米。相应地将发射窗口配置为500至550纳米和570至620纳米。

对于Z系列及三维成像，选择ND采集模式。将Z步进设置为1微米，并根据需要进行调整。参数配置完成后，选择实时模式，以在单独及合并的荧光通道中观察牙龈区域。

然后点击“立即运行”以开始图像采集。为测量通透性，将FD40和RD70的荧光强度分别分配到不同的通道中。合并Z轴切片时无需减去背景。

然后使用 ImageJ 软件定量荧光强度以评估上皮屏障通透性。单击文件，选择打开，以在 ImageJ 中打开上颌图像。然后按图像，将图像类型更改为 8 位格式进行分析。

单击“analyze”（分析），选择“set measurements”（设置测量）。然后勾选面积、平均值和积分密度，并单击“okay”（确定）以确认。接着选择所需的通道，并通过单击“image”（图像），选择“adjust”（调整），然后选择“threshold”（阈值）来调整阈值。

启用暗背景选项以处理黑色背景。点击“分析”，选择“设置测量”。然后勾选“平均灰度值”和“限定于阈值”，点击“确定”进行确认。

使用自由选择工具，手动勾勒出牙龈组织侧荧光信号区域的轮廓。点击分析并选择测量，以获取荧光强度值，其中积分密度代表荧光强度。将测量结果复制到电子表格中进行计算和绘图。

在电子表格中计算对照组的平均荧光强度。将每个实验组的荧光强度值除以对照组的平均值，得到相对荧光强度。在对照组中，两种荧光示踪剂主要局限于牙龈表面。

在结扎组和牙龈卟啉单胞菌处理组中，均观察到FD40和RD70显著渗出至牙龈上皮。半定量分析显示，结扎组和牙龈卟啉单胞菌处理组中FD40和RD70的荧光强度均显著增加。三维成像显示，与对照组相比，结扎组和牙龈卟啉单胞菌处理组中牙龈血管周围示踪剂荧光的分布范围更广且更为弥散。

本方案用于定量小鼠牙龈细胞旁通路屏障的通透性和完整性。该方案可与显微CT结合，用于多模态图像分析。进一步的研究可探索口腔疾病中屏障修复药物及其分子机制。