使用荧光抗体对小鼠表皮石蜡切片进行免疫组织化学染色

在表皮中。免疫组织化学是将特定蛋白质定位至其表达区室的有效方法。在本视频中，我们展示了一种在表皮中进行蛋白质免疫定位的可靠方法，该方法在我们的实验室中常规使用。

您好，我是来自渥太华健康研究所慢性病项目低层建筑中Turin博士实验室的Tammy。今天我们将向您展示一种使用荧光抗体对小鼠表皮石蜡包埋组织切片进行免疫组织化学染色的实验方法。在我们实验室中，已针对采用BO'S固定的组织样本，优化了表皮分化标志物的免疫定位检测方案。

作为优化步骤的一部分，我们在固定前将皮肤平铺在纸巾上以保持其平整。该流程包括表皮解剖、固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、再水化、抗原修复、抗体标记，最后通过落射荧光进行封片与观察。那么，让我们开始吧。

使用新生小鼠时，无需剃除背部皮肤。然而，当使用毛发较多的较大小鼠时，需要剃除背部皮肤，以免其妨碍切片操作。在进行解剖时，应格外小心，避免将镊子接触或损伤后续实验所需使用的皮肤区域。

因此，我们的操作是将镊子放在准备切割的边缘位置，然后非常小心地提起，切开表皮，注意不要触碰实验中需要使用的区域。在固定皮肤时，我们不希望皮肤卷曲并进入管内，而是要让它保持平整。

为了达到这一目的，我们将皮肤平铺在一张纸巾上，使其在固定过程中保持平整。现在皮肤已在纸巾上平整放置，接下来用剪刀剪去边缘部分，或进行修整，以去除可能被镊子损伤的区域。然后将皮肤切成约 2 毫米 × 2 毫米的小片。

现在将对组织进行固定。将皮肤切成便于处理的小块后，将其浸入boin溶液中。盖紧管盖，用perfil包裹试管，并置于摇床上。

进行过夜孵育时，必须注意仅在生物素溶液中孵育16至18小时。孵育时间过短或过长都会对组织造成损伤。孵育结束。

用 PBS 清洗组织，然后依次使用 30%、50% 和 70% 乙醇进行洗涤。可见苏丹黑（BO）呈黄色，随着洗涤过程中苏丹黑被稀释，洗涤液的颜色逐渐变浅。每种浓度乙醇洗涤两次，每次 30 分钟。

在乙醇洗涤步骤结束后，将样品置于新鲜的70%乙醇中，并可在4°C条件下保存至后续处理，期间可进行石蜡包埋的短暂通风。与冷冻组织相比，石蜡包埋的优点在于组织完整性更佳，且样品可长期储存。通常情况下，核心设施能够获得更可重复的实验结果。

然而，如果您所在的机构具备相应设备，并有具备专业知识的专职操作人员，也可以在内部进行切片。掌握制作优质切片的技术更像是一门艺术。因此，我们使用核心设施平台。

从核心实验室取回切片后，可以看到切片上带有石蜡。将切片以薄层形式放置在用铝箔包裹的染色架上，如同包裹烤土豆一样，并在55摄氏度下孵育五分钟。孵育结束后，迅速打开铝箔，将切片放入甲苯中，每次五分钟，共清洗三次。

必须注意，这五个分钟的洗涤步骤应严格计时，孵育时间过长，甲苯将对样本产生不利影响。在完成三次洗涤并使用甲苯后，需用100%乙醇快速冲洗一次。由于乙醇与甲苯会形成沉淀物，干扰实验结果，因此这一步骤至关重要，务必牢记。

接下来，将切片依次在95%乙醇中孵育5分钟，70%乙醇中孵育5分钟，再在水中孵育两次，每次5分钟，以使样本复水。此时，组织可进行苏木精和伊红（H&E）染色处理。我们亦利用核心设施进行此项操作。

进行抗原修复时，将500 mL的1×柠檬酸缓冲液倒入1 L的塑料烧杯中，并将载玻片浸入其中。请记得先取下金属手柄，再将烧杯放入微波炉中。以高功率微波处理两次，每次5分钟。

请记住在两次孵育之间打开微波炉门以使其降温。微波处理完成后，将载玻片从煮沸的柠檬酸盐缓冲液中取出，放入盛有温水的染色缸中。我们仅使用温自来水，此步骤的目的是使载玻片从沸腾状态缓慢冷却至室温。

现在可以用 PBS 将玻片清洗三次，每次五分钟，然后即可开始进行免疫组织化学实验。开始免疫染色前，首先需要用一张纸巾将标本周围的区域擦干。为了防止抗体交叉污染，我们使用液体阻断剂在标本周围划出界限。

通过将滤纸放入培养皿中来准备一个加湿的孵育盒。用蒸馏水浸湿滤纸，去除多余的水分，然后放入载玻片。使用加湿孵育盒的目的是确保在孵育期间载玻片不会干燥。

切片干燥非常重要，因为干燥会增加背景信号。此时切片需用封闭缓冲液封闭30分钟。封闭后，将切片转移回切片架中，并在洗涤缓冲液中孵育。

像之前一样去除多余的缓冲液。将玻片放回湿盒中，在室温下与一抗孵育一小时。

当一小时的孵育时间结束后，将玻片放回玻片架中，并用洗涤缓冲液洗涤三次，每次10分钟。洗涤完成后，用纸巾吸去标本周围的多余洗涤缓冲液。将玻片重新放回湿盒中，在室温下加入二抗孵育一小时；孵育结束后，用洗涤缓冲液更换三次，每次15分钟。

接下来，用 PBS 清洗三次，每次五分钟。去除标本周围多余的液体，并将载玻片背面的 PBS 擦去，以便将盖玻片封片。我们使用含 2.5% DAB 的显色液。

为减少褪色，将 80 微升试剂逐滴加入载玻片，注意避免产生气泡。然后缓慢地盖上盖玻片。

注意不要留下任何气泡。气泡是有害的，因为它们常常会停留在您的样本上，而这正是您在移动装置干燥后想要拍照的位置。现在您已准备就绪，请检查您的载玻片。

以下是使用 FITC 滤光片观察到的成功染色结果。在 20 倍物镜下，可见 claudin-6 表达于表皮所有基底层上方的各层细胞中。本实验室对表皮中 claudin 蛋白的表达及其定位具有浓厚研究兴趣。

关于紧密连接以及表皮渗透屏障的形成，我们刚刚向您展示了如何在小鼠皮肤上进行免疫组织化学实验。在进行该操作时，需要牢记：组织切片应保持平整，并确保在各孵育步骤之间载玻片不会干燥。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。