用于小鼠默认模式网络纵向多模态电生理记录的大尺寸可重复密封颅窗手术方案

默认模式网络（DMN）是一个重要的大规模网络，参与多种认知功能，并与抑郁症等神经精神疾病相关。在动物模型中研究DMN复杂的动态特性，对于理解其在健康和病理状态下的功能具有重要价值。然而，一个重大挑战是在清醒且行为自由的小鼠中，对DMN多个深层且分布广泛的节点进行稳定、长期和大规模的电生理记录。

本文介绍了一种由Eero Castren实验室开发的新型双阶段手术方案。该技术可构建一个大尺寸、持久且可重复密封的颅窗，实现同时对超过1,000个电极通道进行多次纵向记录。该方法结合了表面微电极皮层脑电图（micro-ECoG）与两根Neuropixels探针，从而前所未有地实现了对默认模式网络的深入观测。

本视频将逐步介绍这一可靠的外科手术操作流程，从动物准备和头固定板植入到慢性颅窗的制备，确保为神经网络科学研究获取高质量、长期的实验数据。所有操作程序均已获得芬兰国家实验委员会批准，并符合欧洲关于用于科学目的动物保护的指令。第一阶段：动物准备与头固定板植入。

进行此操作时，首先准备所有必要的手术材料和器械。使用 4% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并以每分钟 0.5 升的氧气流速将麻醉维持在 1.5% 至 2.5%。剃除小鼠头部顶部的毛发，并将动物放置在带有内部温度传感器的控温加热垫上，该传感器校准为在整个操作过程中维持体温在 37 摄氏度。

涂抹卡波姆眼膏以防止角膜干燥。将小鼠固定于立体定位仪中，使颅骨保持水平，通过皮下注射给予术前镇痛药和抗炎药物，包括卡洛芬、丁丙诺啡和地塞米松。使用聚维酮碘溶液对剃毛区域进行消毒，并在头皮皮下注射含肾上腺素的利多卡因溶液作为局部麻醉。

在耳线处做一个小的横向切口，并逐步扩大切口，以完全暴露颅骨表面顶部。用丙酮仔细清洁暴露的颅骨，直至去除所有可见的骨膜，以确保植入物能够牢固粘附。使用钝头圆形手术刀片去除丙酮清洗未能完全清除的残留骨膜和结缔组织碎片。

使用立体定位仪，在颅骨上以颅骨缝合点（bregma）为参照，标记一个 4 毫米 × 7.6 毫米的矩形区域。该矩形应从 bregma 向左右两侧各延伸 2 毫米，向前（吻侧）延伸 3 毫米，向后（尾侧）延伸 4.6 毫米。接下来，在右侧大脑半球标记两个颅内探针插入位点。

在前囟前方 1.66 毫米、外侧 1.95 毫米处标记头端探针位置，在前囟后方 2.2 毫米、外侧 1.9 毫米处标记尾端探针位置。接下来，使用 11 号手术刀片在指定窗口区域外所有暴露的骨表面刻划交叉网格图案，形成深度约为 0.2 至 0.4 毫米的浅而清晰的凹槽，构成约 1×1 毫米的均匀方格。通过将无菌 30G 针头安装到棉签末端，并将针头弯成 V 形，制备一个精细的胶水涂抹工具。

将氰基丙烯酸酯胶水滴入一次性塑料称量皿中，并将涂胶工具浸入胶水容器内。将胶水涂抹于所有暴露和雕刻的骨表面，每个部位仅涂抹一次，确保覆盖完全但不过量。待胶水干燥七分钟后，再进行后续操作。

植入参考套管时，选择左侧小脑区域作为钻孔位置，以避开可见的浅表血管。使用圆形钢制磨头以每分钟20,000至25,000转的速度，分5到10秒的短时 bursts 进行钻孔，直至骨孔变得较为半透明，显现出淡粉色。将镀金参考套管插入导孔中，用氰基丙烯酸酯胶水固定，并用紫外光固化牙科水泥加强连接处。

使用LED固化笔照射牙科水泥，固化一分钟。接着，在暴露的吻侧颅骨顶端放置少量紫外光固化型牙科水泥，将头固定板置于颅骨下方，使其一端置于围绕参考插座已固化的牙科水泥支架上，另一端置于新鲜的吻侧水泥点上。确保头固定板居中且水平。

通过在头板基部周围涂抹牙科水泥，并环绕刻蚀的骨面和参考插座，直至在颅窗预定区域的周边形成连续且密封的封闭结构，以增强整体稳定性。最后，使用LED固化笔光源照射牙科水泥一分钟使其完全固化。待水泥完全固化后，让小鼠从麻醉状态中苏醒。

第一阶段现已完成。在进入下一阶段之前，让小鼠恢复至少48小时。第二阶段：慢性颅窗制作。

第二阶段所需的工具和药物与第一阶段相同，但不需要局部麻醉药。此外，该阶段还需要一个无菌的薄型聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜、置于冰上的冷人工脑脊液、一种弹性硅胶密封剂以及一个定制的3D打印保护帽。在第一次手术至少48小时后，使用异氟烷重新麻醉小鼠，将其放置在立体定位仪的加热垫上，并给予术前药物，但无需使用利多卡因-肾上腺素局部麻醉药。

使用牙科钻头沿第一阶段标记的矩形轮廓开始对骨组织进行减薄，钻机转速设为每分钟25,000转，钻头与骨表面保持90度角，沿矩形边缘进行一至两次略深的 passes，以形成初始切割沟槽。在颅窗附近两个探针插入坐标的骨组织和牙科水泥上钻出浅沟。这些沟槽可作为持久的视觉标记物，在骨瓣移除后仍清晰可见，用于在后续电生理记录会话中重复、准确地重新定位颅内探针。

在整个钻孔过程中，定期使用冰冷的无菌人工脑脊液，以防止对下方皮层造成热损伤，并减少出血。随着骨质变薄，逐步将钻头速度降低至每分钟 20,000 转。沿矩形边缘继续钻孔，直至轮廓内的骨质变薄约 90%。

切勿完全钻透颅骨。更换为精细的弯头硬脑膜钩。将钩尖极度小心地插入薄骨边缘下方，沿骨窗边缘滑动钩子，仔细将骨瓣与周围颅骨及下方组织分离。

使用脑膜钩从后向前小心抬起已成功分离的骨瓣，使其与颅骨表面成约35度角。用镊子夹住抬起的边缘，轻轻左右摇动，直至骨瓣完全松脱。用冰冻的ACSF反复冲洗暴露区域，清除凝固的血液。

待出血停止后，将一片无菌的预制PDMS膜直接置于硬脑膜表面。若尺寸合适，该膜将精确覆盖窗口，并被动贴附于硬脑膜上，使其平整地紧贴脑组织。使用硅胶密封剂封闭开颅部位。

用牙科水泥填充头固定板与BDMS膜边缘之间的所有缝隙，完全包绕并覆盖BDMS膜的边缘。使用少量氰基丙烯酸酯胶水将定制的3D打印保护帽固定在头固定板上，以保护记录间隙期间的观察窗口。小鼠现已准备好恢复，应转移至其单独饲养的家笼中，以防止植入物受损。

成功的手术会在大脑皮层上形成一个清晰透明的观察窗，能够清晰看到血管结构，且炎症或感染迹象极轻微。这种清晰状态可维持超过21天，从而支持长期的纵向研究。通过慢性观察窗记录的原始电生理信号在整个纵向观察期间均保持高质量。

此处并排显示了来自一只动物后部压后皮层网格电极在首次记录日和21天后采集的代表性宽带微皮层脑电图（micro-ECoG）信号，以及同时从浅层皮层通道采集的颅内探针局部场电位信号。第21天记录的信号在幅度、频谱成分以及运动和噪声伪影的消除方面均与第0天记录的信号相当，证实了PDMS膜和硅胶密封层的长期存在以及反复的硬脑膜穿刺并未导致浅层皮层区域——即信号退化最可能首先出现的区域——表面电极或颅内探针信号质量的可检测下降。该技术的主要验证依据是能够随时间稳定获取高质量的多模态电生理数据。

可重复密封的窗口允许反复插入探针，从而在数周内对相同的神经元群体进行记录。在α频段，通过颅内高密度电极探针尾端通道计算得到的相位锁定值矩阵显示，基线期与治疗后第21天的记录会话之间具有稳定的功能性结构。这表明探针可重复插入至相同的皮层位置，而非对同一单个神经元进行正式的示踪。

尽管小腿部位的微小移位使得无法断言记录的是完全相同的神经单元，但α频段相互作用的整体层状和区域结构得以保留，表明慢性窗允许对同一功能环路进行纵向采样。为了直接验证慢性窗是否支持在不同记录会话之间对相同深层结构进行可重复的层状定位，我们利用探针的LFP通道计算了电流源密度（CSD）图谱。刺激诱发的CSD图谱显示，预期的层状电流汇与电流源特征——包括前边缘皮层和前扣带区——在不同会话之间保持一致。

两个实验会话之间的层流功率谱重叠度高度相似，皮尔逊相关系数为0.81。在次级运动皮层观察到的差异可能源于记录期间动物运动状态的不同。由于电流源密度（CSD）图包含解剖学信息，因此可在单次实验过程中提供一种非终末式的读数，用以判断每个探针当前正在采集哪些脑区的信号，而无需依赖实验后对脑组织的染色分析。

表面微电皮层脑电图（micro-ECoG）电极放置在不同实验周期间的可重复性独立于颅内电流源密度（CSD）读数进行量化。将第0天和第21天由micro-ECoG网格计算得到的频带限制性空间功率图叠加，并分别对吻侧和尾侧子网格计算两幅图的像素级相关性。子网格轮廓相关性保持较高水平，且两个实验周期的空间条形码在阵列的吻侧和尾侧半区均明显共定位于相同的皮层功率热点区域。

通过半透明网格可见的正弦对齐队列，以及探针插入坐标处刻有的骨槽，因此可在21天的纵向观察期内实现微小脑皮层电图（micro-ECoG）植入的毫米级可重复性。为进一步验证该技术，在开颅手术约四周后的尸检脑切片上，进行了针对GFAP和IBA1的免疫组织化学染色。GFAP由星形胶质细胞表达，这类细胞在反应性胶质增生（如脑损伤或炎症）中表达上调。

另一方面，IBA1 由小胶质细胞表达，这些细胞在神经炎症过程中更为活跃。验证队列由接受完整两阶段手术的动物组成，颅窗在术后第 0、21 和 22 天依次重新打开三次。然而，该队列未进行微阵列皮层脑电图（micro-ECoG）放置，也未实施颅内探针插入。

在每次实验之间，窗口被重新密封，如同在进行电生理记录时一样。因此，该队列可将慢性窗口和反复硬脑膜暴露引起的炎症反应与任何探针导致的组织损伤分离开来。在未进行手术的对照组与接受手术的载体组之间，两种标志物均未观察到显著差异。

这些代表性显微图像显示，在窗口正下方区域未见明显的反应性胶质增生或小胶质细胞活化的定性证据。然而，分别在探针穿行路径附近以及探针插入半球区域观察到轻微的小胶质细胞和星形胶质细胞活化，这可能归因于颅内探针插入速度过快。成功的手术可使大脑皮层表面形成清晰透明的窗口，且炎症反应极轻微。

慢性处理期后，可能会出现一定程度的脑肿胀。可通过密切监测来管理，必要时可给予额外的镇痛剂。对于记录，只需取下帽盖和密封材料，放置微小皮层脑电图网格（micro-ECoG grids）和Neuropixels探针，即可开始对清醒且行为正常动物进行数据采集。

综上所述，这种双阶段手术方案为在小鼠中创建大型慢性颅窗提供了一种可靠且高效的方法。该手术的关键优势在于对硬脑膜的损伤极小，并能提供广阔的暴露区域，这对于同时放置表面微米级皮层脑电图（micro-ECoG）网格电极和多个深部脑神经像素（Neuropixels）探针至关重要。该方法使得对默认模式网络（DMN）及其他大规模神经环路中全网络范围的电生理动态进行前所未有的长期纵向研究成为可能。

这为深入研究复杂行为的神经基础以及脑部疾病的病理生理学机制打开了大门，最终有助于开发新的治疗方法。