从老年泪腺和唾液腺中分离肌上皮细胞与成纤维细胞的单细胞解离、RNA测序操作方案

我的实验室利用流式细胞术和单细胞RNA测序技术，研究衰老相关的唾液腺和泪腺变化如何影响不同类型的细胞。传统的解离方法难以有效回收衰老唾液腺和泪腺中脆弱的上皮细胞。而我的实验方案可提高细胞活性，实现可靠的单细胞分析和细胞分选。

首先，将已处死的小鼠仰卧位放置于解剖台上。使用精细镊子和剪刀，从眼与耳之间的位置切开皮肤。轻柔地牵拉皮肤以暴露泪腺。

使用钝头镊子轻轻提起泪腺。通过轻柔地以环形动作剥离周围结缔组织，仔细分离。辨认泪腺的可见边界，并将其与邻近组织（包括腮腺）分离。

然后将泪腺转移至一个含有2毫升冰冷PBS、置于冰上的35毫米培养皿中。在解剖显微镜下，去除残留的脂肪，并小心剥离泪腺表面的结缔组织被膜。将一个无菌的35毫米培养皿置于冰上备用。

向培养皿中央加入 800 至 1000 微升冷 PBS，并将一个泪腺转移至 PBS 中。确保组织始终浸没在 PBS 中。使用两把无菌手术刀，将泪腺仔细切碎成小片段，直至形成柔软的糊状物。

将组织碎片收集至培养皿的一侧。吸除残留的 PBS，并用一毫升新鲜的冷 PBS 清洗碎片。将清洗后的组织碎片转移至 12 孔板中，每孔加入两毫升预热的消化液。

将培养皿放入摇动水浴中，在 37 摄氏度、60 转/分钟的条件下孵育 30 分钟。使用宽口 1 毫升移液器吸头，轻轻吹打组织 15 次。将培养皿重新放回摇动水浴中，继续孵育 30 分钟。

接下来，使用普通的1毫升移液枪头，轻轻吹打样本10次，再次孵育30分钟。然后再次轻轻吹打样本10次，并将细胞悬液转移至2毫升离心管中。向培养板的每个孔中加入1毫升预冷的封闭液一（BM1），以收集含有残留细胞的消化液，并将培养板置于冰上，直至下一步操作。

将含有细胞悬液的离心管在4°C条件下以300 G离心5分钟。弃去每管中的上清液。将含有残留细胞的培养板各孔中的BM1转移至对应的离心管中。

接下来，向每个孔中加入 600 µL 冷的 BM1 以洗涤残留的细胞，并将洗涤液转移至相应的离心管中，与细胞悬液合并。轻轻重悬细胞悬液。将离心管再次在 4 °C 条件下以 300 ×g 离心 5 分钟，弃去上清液。

向细胞沉淀中加入1 mL的Accutase，轻轻重悬细胞。将离心管置于37°C、60 rpm条件下孵育5至10分钟。使用1 mL移液枪头，轻柔吹打样本10次。

然后向管中加入1毫升冷的BM2，通过稀释Accutase来终止酶反应。在4°C下以300 ×g离心5分钟，并弃去上清液。向管中加入含有DNase 1的培养基，DNase 1浓度为每毫升200单位，重悬细胞并加培养基至管口。

将试管在室温下孵育10分钟，并在5分钟后轻轻重悬一次。同时，将一个70微米的细胞筛置于15毫升锥形管上，并用1毫升BM3预湿筛网。孵育结束后，将细胞悬液转移至筛网上。

向原始收集管中加入一毫升 BM3 以冲洗管壁，并将冲洗液转移至同一滤器中。再用额外的五毫升 BM3 冲洗滤器。最后，使用台盼蓝染色法和自动细胞计数仪测定滤后细胞悬液的细胞浓度和细胞活力。

进行后续应用，例如用于基因表达谱分析的单细胞RNA测序，或基于流式细胞术对荧光标记的细胞群体进行分选。单细胞RNA测序数据的UMAP分析在泪腺中鉴定了代表性良好的上皮和间质细胞群体，包括肌上皮细胞和成纤维细胞，以及多种免疫细胞群体。衰老的泪腺中含有大量表达IGHM和IGHD的浆细胞和活化B细胞。

通过连续的流式细胞术设门，可清晰区分出EpCAM阳性、GFP阳性的肌上皮细胞与EpCAM阴性、GFP阳性的血管壁细胞。表达PDGFRα的GFP阳性成纤维细胞为EpCAM阴性，因而可与上皮细胞相区分。在PDGFRα-EGFP小鼠中，所有GFP阳性细胞均表达I型胶原，证实其成纤维细胞身份。

流式细胞术分析显示，99.6%的GFP阳性细胞对应于PDGFR alpha免疫染色的细胞。本方案旨在从泪腺中分离出有活力的单细胞，用于上皮、间质和免疫细胞群体的分子表征。主要挑战是在解离脆弱的老化组织时，尽量减少机械和酶解损伤，同时保持较高的细胞活力，以适用于单细胞RNA测序。

按照此操作步骤，分离的细胞可用于单细胞RNA测序、批量RNA测序以及特定细胞群体的分子谱型分析。分选后的细胞也可培养用于下游功能检测。