优化激光显微切割技术以分离新鲜冷冻人组织中的肠神经节

该方法有助于回答有关肠神经系统的关键问题，例如成人人类肠道中肠神经节的表达谱。该技术的主要优势在于，可在最大程度保持RNA质量的同时，从人肠神经节中获得高产量的RNA。起始材料为切成20厘米长度的肠道组织。

首先，去除脂肪组织和结缔组织。注意避免划伤浆膜，以免造成肌间神经丛的结构损伤。接着，沿修剪后样本的全长做一纵向切口，最好在肠系膜附着处进行。

然后，剥离并弃去结肠上的结肠带，使组织能够展平。接着，将肠管展开，黏膜面朝下，置于冷藏的切板上。随后，沿组织全长切割成1.25厘米宽的条状。

切割后，立即将每一片段转移至预冷的组织保存液中进行临时保存。接着，将每条组织条切成2至1.5厘米长的片段。将组织条切分完毕后，用吸水纸吸干片段表面液体。

组织必须充分干燥，以防止冷冻时在组织上形成冰晶。现在，将干燥的组织片黏膜面朝上，排列在冰冷的一次性塑料模具上。然后用弯头镊子压平每一片组织，以去除夹带的气泡。

组织在压平时会扩张。压平组织片段后，在冷冻前评估其厚度。如有需要，将样本边缘向内推压，直至肠组织样本接近其原始厚度。

现在，将装有样品的底模转移至干冰与2-甲基丁烷的混合物中。组织应在30至60秒内完全冻结。随后，立即使用预先置于干冰上的低温湿巾擦拭模具底部，使其干燥。

现在检查样品。注意观察是否有样品表面不平整。接下来，用预先标记并冷藏过的铝箔包裹模具。

然后，用一层塑料膜覆盖锡箔，以尽量减少脱水。将样品置于冰上，直至可储存于零下80摄氏度。在准备好所需材料后，将3至5毫米高的TFM小丘倒入大型冷冻切片机样本托上，并立即将肠道样本（浆膜面朝上）转移至TFM上。

在室温下放置数秒后，将样本架转移至干冰中，并用粉末状干冰覆盖。切片前，确保TFM位于肠肌神经丛平面以下。接着，将样本架安装到冷冻切片机的样本头中，并将样本与冷冻切片机刀片对齐。

使肌间神经丛的平面与切片刀平行。现在，从浆膜层和纵行肌开始进行8微米厚的切片，直至到达肌间神经丛。为定位肌间神经丛，可取一组织样本制片，并使用水溶性染料（如1%结晶紫）染色。

继续操作时，需辨认纵行肌层与环形肌层之间的交界处。在开始切片时，浆膜层将因存在结缔组织而被识别。部分残留的肠系膜脂肪也可能存在于浆膜层周围。

随后，外层纵行肌层的片状结构将变得可见。当达到纵行肌层与环行肌层之间的边界时，即可观察到部分肠神经节。在接下来的数个切片中，肌间神经丛将变得十分明显，单个切片内可见大范围的神经节群。此时，收集连续切片用于激光捕获显微切割。

将PEN载玻片在冷冻切片机中冷却5到10秒，然后用其贴附组织切片。最佳切片应含有大量神经元和胶质细胞。随后，按照文本方案中所述步骤进行染色，然后脱水。

准备时，将 LCM 帽插入 LCM 显微镜载物台中。然后将样本载玻片装入载物台，并获取载玻片的概览图像。确定 LCM 所需的位置，并将帽加载到载玻片上。

然后，校准红外激光器，并调整激光的功率和持续时间，以获得直径为20至30微米的捕获点。接下来，勾画出需要采集的神经节区域。务必确保操作范围位于盖片上可采集区域的边界内，该区域以绿色圆形显示。

对于每个由紫外切割轨迹标出的神经节，调整红外光斑的位置，确保每100至500微米范围内至少有一个红外光斑，以保证在将帽体从样本上提起时能够完整收集所有神经节。然后，按下红外紫外切割按钮，开始收集所有标记的神经节。完成收集后，将帽体移至新的位置，并重复收集过程。

此步骤可重复60至80分钟。当LCM帽上收集到足够数量的神经节后，将其转移至质量控制工作站。如果帽上有碎片残留，使用已为RNA实验准备好的细头画笔轻轻擦拭去除。

对于难以去除的残留物，可使用移液器吸头进行处理。然后，将盖子拧紧在一个装有 230 微升 RNA 裂解缓冲液的 0.5 毫升微量离心管上。将离心管倒置，短暂涡旋振荡，随后在室温下孵育 30 分钟。

随后，将样品在5,000 ×g或更高的条件下离心5分钟，然后将微量离心管转移至干冰中。样品此时已准备好进行RNA提取。每份样品采集两顶肠神经节时，可获得超过1纳克的RNA，足以用于RNA测序，且RNA质量优良。

所示样品的RNA完整性为8.3。同时收集了完整性数值为7.5和6.9的样品。总体而言，所有制备样品中超过95%的样品质量足以用于RNA测序。

使用生物信息学流程对RNA-Seq数据集的质量进行了评估。末端偏差表明样本已成功测序，且仅存在轻微的3'端偏差。基因生物类型图显示测序结果总体一致。

一旦掌握，该技术可在短短 8 到 12 小时内从肠神经节中获取足够质量和数量的 RNA 生物学重复样本，用于 RNA-Seq 分析。在实施该操作过程中，关键是要将人肠道样本尽可能平展地冷冻。这将确保您能够收集到大面积的人肠神经节横截面，并可通过激光捕获显微切割技术快速、便捷地进行处理。