利用基于荧光融合蛋白的报告系统对细胞中基因毒素诱导的PARP1/PARP2激活进行可视化与定量分析

本实验室研究正常细胞和转化细胞中PARP1和PARP2依赖的DNA修复及DNA损伤应答通路。该领域的一个挑战是在避免细胞裂解的情况下，对细胞内PARP1和PARP2的活化进行定量分析。这使得能够开展亚细胞定位研究。

首先，向一个1.5毫升的无菌微量离心管中加入375微升胎牛血清和不含青霉素-链霉素的DMEM培养基。然后，向该管中加入10微升脂质体转染试剂以及所有所需的质粒。轻轻敲击微量离心管，以混匀培养基、转染试剂和质粒DNA。

室温孵育15至30分钟，以使DNA与转染试剂形成复合物。接着，将质粒与转染试剂的混合物逐滴加入含有培养的293FT细胞的60毫米培养皿中，无需更换培养基，然后将细胞放回培养箱中继续培养48小时。随后，收集转染后的293FT细胞的培养上清。

为了分离慢病毒颗粒，将收集的培养基通过无菌的0.45微米滤膜过滤，以去除细胞碎片并分离出慢病毒颗粒。进行转导时，取培养24小时后处于对数生长期的靶细胞，并确认细胞融合度在20%至40%之间。接着，在一个15毫升的锥形管中加入1毫升病毒液、1毫升生长培养基和2微升Polybrene，轻轻颠倒混匀。然后，吸去六孔板中的生长培养基。

将病毒、培养基和Polybrene混合物加入每个孔中。将含有转导混合物的细胞置于含加湿 atmosphere 的培养箱中，在32摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育16至18小时。为验证RNF146氨基酸的表达，100至182 EGFP，每张含盖玻片的培养皿接种200,000个表达LivePAR的活细胞。

让细胞在盖玻片上贴壁、培养基预处理并开始复制，时间为24至36小时。然后将表达LivePAR的细胞暴露于指定试剂中。将化合物直接加入含有盖玻片细胞的培养基中，并轻轻晃动细胞培养皿中的培养基以分散化合物。

将60毫米培养皿在37摄氏度下孵育60至90分钟。固定细胞时，移除培养基并用PBS洗涤细胞。在室温下用含4%甲醛的PBS溶液预固定细胞15分钟。

去除甲醛后，用 PBS 洗涤细胞三次。然后，按 7:3 的比例向细胞中加入 3 毫升冷甲醇和丙酮以固定细胞。将培养皿置于 -20 °C 环境下 9 分钟。

然后，去除甲醇-丙酮溶液。用 PBS 洗涤细胞三次后，用移液器吸取 15 µL 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂滴加到载玻片上。将盖玻片细胞面朝内轻轻覆于封片剂上，尽量避免产生气泡。

将盖玻片居中并固定在载玻片上，通过在边缘涂抹少量透明护甲油指甲油来封边。将载玻片置于避光处，使指甲油充分干燥。下载并安装 Image J 后，打开 Image J，通过点击 Plugins（插件），选择 Macros（宏），然后选择 Install（安装），来安装宏文本文件 LivePAR_Macro。

在 Image J 中打开所有共聚焦图像文件，并将文件另存为 TIFF 格式以保留原始文件。然后，打开一个电子表格文档，并将其保存为“日期_细胞系焦点分析”。一次分析一个 TIFF 文件。

按 1 键以识别细胞核。当 ROI 管理器窗口打开后，选择所有条目并按“添加”按钮，将细胞核区域叠加到原始图像上。删除错误识别的细胞核，并排除未完全位于视野范围内的细胞核。

然后，使用自由选择工具圈选出细胞核，并按 2 以定量 PAR 焦点。在 ROI 管理器中依次选择每个细胞核，统计每个细胞核中的焦点数量。在完成文件中所有细胞核的计分后，将定量数据复制并粘贴到打开的电子表格文档中。

类似地，对所有TIFF文件重复上述分析。完成后，使用选定的软件绘制每个细胞核中PAR焦点的数量。对照组细胞显示出全细胞的EGFP染色。

经基因毒素处理的细胞显示出核内焦点的聚集，代表其在细胞核内的定位。使用PARP1和PARP2抑制剂维利帕尼进行预处理后，导致PAR焦点消失。对不同时间和处理条件下每细胞核中PAR焦点数量的定量分析显示了类似的结果。

本方案使我们能够定量分析在基因毒素作用下以及遗传改变后PARP1和PARP2信号通路的激活情况。在本检测中，我们采用了传统的免疫荧光技术，以验证蛋白质与聚ADP-核糖的共定位。未来，我们将利用该检测方法进行基因毒性测试，用于高通量分析PARP1、PARP2或PARP抑制剂，并鉴定参与PARP1和PARP2信号通路的新因子。