利用溶液核磁共振技术在两相条件下表征生物大分子凝聚体

我们开发了核磁共振（NMR）方法用于研究生物大分子凝聚体。这些凝聚体对细胞组织至关重要，但其异常与多种疾病相关。利用我们的方法，可以研究凝聚体的材料特性，分析其形成机制，并监测长期变化过程，如凝聚体的成熟或生物分子的病理性纤维化。

首先，在1.5毫升微量离心管中，将蛋白质储备液、RNA储备液或两者与相应的温热琼脂糖缓冲液混合，制备由琼脂糖水凝胶稳定的最终双相样品。用于核磁共振检测时，蛋白质或RNA的终浓度通常为50至500微摩尔。将制备好的双相样品插入波谱仪中，然后照常进行锁场、匀场、匹配和调谐质子通道。

使用常规校准程序校准质子通道的90度脉冲长度。然后记录一维水峰抑制谱，并检查谱图中是否含有较强的生物分子信号。若未观察到信号或信号极弱，则不应继续进行REDIFINE实验，而应改用CONDENSE-MT方法。

记录一次扩散有序光谱实验，将扩散梯度强度以16个线性步长从2%调节至95%。为了继续采集完整的REDIFINE数据集，通过复制刚刚运行的初始实验参数，创建九个新的step PPP GPQ S19实验。在每个连续的实验中，仅以可变步长改变D20扩散延迟，使其覆盖从100到1000毫秒的范围。

使用适当的命令运行每个实验。在全部10次实验中，使用最后的N值以保持接收增益恒定。将Q Sign设置为以SSB2作为窗函数。

然后使用适当的命令提取第五个切片。对一维谱图进行相位校正，并将相位参数保存到二维数据集中。使用XF2处理二维数据集，并用ABS2进行基线校正。

随后，使用分段二维方法提取这16个切片。对剩余的九次实验重复类似的步骤。至少检查前四到五个切片，以确保相位校正和基线校正正确无误。

如有需要，手动校正相位和基线。然后使用合适的 MATLAB 代码进行分析。在代码中，根据探针梯度强度修改扩散时间、设置 PG 值，并根据实验总数将实验编号设为 1 至 10。

然后使用此代码根据 REDIFINE 模型拟合数据。记录一维水峰抑制谱。如果观测到的信号非常弱，则进行 CONDENSE-MT 实验。

通过T1反转恢复法测定水的R1弛豫率，用于定量CONDENSE-MT。将提供的脉冲序列和VD列表复制到相应文件夹中。在完成质子90度脉冲校准后，设置NS为2，DS为0，D1为20秒，SW为10 ppm。

TD2 设置为 16K，TD1 设置为 24。对于 CONDENSE-MT 实验，将提供的 Bruker 参数集、序列和频率列表复制到 Bruker 对应的文件夹中，然后根据波谱仪调整频率和功率。

将P1设置为校准后的90度脉冲长度，P4设置为1微秒，以避免辐射阻尼效应。将NS设为2，DS设为16，D1设为4秒，SW2设为20 ppm，TD2设为8k，TD1设为频率列表的长度。将SPNAM10设为Squa100,000，并将P10设为5秒。

找到产生 100 赫兹照射的 SP10 功率。相应地调节照射脉冲的 SP10 功率。使用适当的命令运行准二维实验，并设置一系列此类准二维实验，改变 SP10 照射功率。

调整所有参数后，运行代码以读取核磁共振（NMR）谱图，该代码将对水信号进行积分，并将其保存到一个新变量中。在反演恢复代码中，调整至相应数据的路径，并检查水信号积分区域。然后，调整包含反演恢复数据的实验编号。

设置所有实验参数，并输入先前通过以类似方式拟合琼脂糖数据集获得的琼脂糖空白池值。运行压缩空白代码的第一部分，以获得水纵向弛豫的拟合结果。然后运行压缩空白拟合部分，启动实时图形，显示拟合函数的最小化过程。

运行代码的下一部分以确定不确定度并绘制数据。REDIFINE 拟合确定了 FUS N 端结构域样品在稀相和浓相中的扩散系数、浓相中蛋白质的占比、液滴的平均尺寸以及相间通透性。FUS N 端结构域的核磁共振（NMR）信号在浓相中仍可检测到。

在相位分辨样品中，琼脂糖参照物与FUS N端结构域之间的磁化转移谱型未观察到差异。对于CAG重复RNA凝聚体，未检测到NMR信号。因此，其磁化转移谱型与琼脂糖参照物显著不同。

CONDENSE-MT 实验提供了对重复序列扩增RNA凝聚体的动态表征。CONDENSE-MT 分析得到了凝聚体与体相水之间的质子交换动力学参数。该分析还获得了RNA在凝聚体中的横向弛豫时间以及体相水的表观横向弛豫速率。

在本实验方案中，我们能够在无需化学标记的情况下表征两相状态中的凝聚体性质。液滴与稀相环境共存，允许两相之间进行物质交换，模拟细胞内的环境。我们专注于凝聚体表征的方法可与传统的核磁共振（NMR）方法相结合，用于研究跨相的分子结构相互作用及动力学过程。

在未来的研究中，我们旨在开发更复杂的凝聚体模型，将该方法学拓展至更复杂的体系，并最终在细胞内环境中直接研究凝聚体。