一种用于将 Euglena gracilis 适应于木薯基底物以进行异养培养的方法

我们的研究重点是将新培养的纤细裸藻（Euglena gracilis）适应于木薯废料，并研究其生长情况、氰化物降解能力以及富含蛋白质的生物量生产。该方案可应用于可持续的木薯加工、农业废弃物高值化利用、饲料生产以及低成本生物技术系统。首先，用底物类型“garri”标记无菌的500毫升带通气盖的锥形瓶。

在烧瓶上标记相应的目标浓度。用重复编号以及计划的灭菌条件（高压灭菌或非高压灭菌）标记烧瓶。将称量舟置于分析天平上。

按下归零后，称取木薯粉以匹配最终工作体积。将称好的木薯粉无菌加入含有300毫升去离子水或蒸馏水的无菌500毫升锥形瓶中。将带通气孔的瓶盖重新盖回每个锥形瓶上。

将每种悬浮液混合3分钟，直至混合物均匀。若使用磁力搅拌，将烧瓶置于搅拌台上，调节转速至200G，形成浅漩涡且不产生飞溅。在25°C下静置悬浮液，静置水化10分钟。

在发酵前立即拧紧通气盖，并用手轻轻摇晃烧瓶五次，以轻柔地混匀混合物并重新悬浮已沉降的物质。如需制备更多木薯产物培养基，请参照之前的方法标记烧瓶并称量底物，根据工作体积使底物浓度达到每升30克。将称量好的底物无菌操作加入含有300毫升去离子水或蒸馏水的无菌烧瓶中。

将通气盖重新安装到每个烧瓶上。按照之前演示的方法进行水合并混匀悬浮液。确认烧瓶已装上无菌透气通气盖，以允许气体交换同时尽量减少环境污染物的进入。

将锥形瓶直立放置于25摄氏度的指定区域，避免阳光直射和高流量气流干扰，静置培养至少72小时。记录每个锥形瓶及对应条件的发酵起始日期和时间。确认每个500毫升锥形瓶在发酵后液体体积不超过300毫升，以防止灭菌过程中发生沸腾溢出。

将通气盖松开至手指拧紧的位置后，在烧瓶上贴上高压灭菌指示胶带。将烧瓶放入可耐受高压灭菌的托盘中，再将托盘放入高压灭菌器内，选择P13液体循环程序。设置灭菌参数为121摄氏度，持续30分钟，以进行液体灭菌。

启动高压灭菌程序。待程序结束后，使高压灭菌室压力恢复至大气压，然后缓慢打开高压灭菌锅门。使用耐热手套取出锥形瓶，并使其冷却至室温。

将冷却后的锥形瓶在接种前于室温下放置过夜。直接使用发酵后的木薯培养基，无需高压灭菌，以保留原有的微生物群落。在72小时发酵期结束后，立即对未高压灭菌的培养基进行接种，以尽量减少意外的环境污染物侵入。

通过在所有底物条件下使用相同类型的500毫升通气盖烧瓶、相同的工作体积和相同的发酵时间，确保各重复组之间操作的一致性。将纤细裸藻接种至新鲜的异养培养基中。将培养物置于完全黑暗条件下，在28°C以120G持续振荡培养，直至培养物进入对数生长中期。

使用明场模式的复式光学显微镜，在100×至400×总放大倍数下观察培养物，确认其具有活跃的运动性、细长的细胞形态以及较低的附着水平。在适应性实验前，排除那些出现大量细胞碎片、形态异常或附着水平升高的培养物。通过拧紧通气盖轻轻均质化起始培养物后，手动旋转锥形瓶15秒，以确保细胞均匀分布，同时避免产生剪切应力。

使用血细胞计数板（Neubauer 血球计数板）测定细胞密度。将培养物轻轻摇动锥形瓶 15 秒使其混匀后，用移液器吸取 1 毫升培养液至无菌的 1.5 毫升微量离心管中。用 70% 乙醇清洁血细胞计数板和盖玻片，并将其置于空气中自然晾干。

用移液器将10微升培养液滴加到血细胞计数板的两个计数区域上，然后将盖玻片覆盖在湿润的样品上。使用10倍物镜的明场显微镜观察，聚焦于计数网格，按照标准边界规则，计数大网格中特定区域内的细胞数。在第二个计数室重复细胞计数，计算每毫升的平均细胞数及细胞密度。

调整接种体积，使所有实验培养基中的最终接种量均为5%（体积比）。针对每种处理条件分别制备接种物，以保持各实验组之间初始细胞密度一致。将制备好的E.gracilis接种物加入已灭菌和未灭菌的木薯培养基中，培养基终浓度分别为每升10、20和30克的加里粉（garri）。

在所有处理条件下使用相等的接种体积，以标准化初始细胞密度。拧紧通气盖后，轻轻以圆形晃动锥形瓶15秒，使细胞均匀分布。将培养物置于完全黑暗、25摄氏度条件下培养，以启动异养生长。

尽量减少对未高压灭菌培养基的搅动，以保持原有的微生物群落结构和底物分层。每天用手轻轻旋转混匀所有培养物一次，持续15秒，以维持伊乐藻细胞与悬浮木薯材料之间的接触。每48小时，使用无菌移液器吸头，从每个培养物中无菌采集1毫升样品。

拧紧通气盖，在取样前轻轻旋转培养瓶15秒，以确保细胞和悬浮物均匀分布。将一定量的培养物转移至无菌的1.5毫升微量离心管后，根据需要用水稀释样品，以改善单个细胞的观察效果。取10微升稀释后的样品，用移液器将其加到干净的载玻片上，盖上盖玻片，制备湿封显微镜片。

使用复合光学显微镜在明场模式下以100倍至400倍的总放大倍数观察样品，评估细胞运动性、形态特征以及坚持频率，作为适应状态的指标。每隔七天，无菌条件下将每种培养物按体积的20%转接至新配制的木薯培养基中，木薯粉（garri）浓度和灭菌条件保持相同。各传代之间的转接体积应保持一致，并持续进行连续传代，直至培养物在每升含30克木薯粉的培养基中表现出稳定的生长、持续的运动性以及较低的坚持频率。

在高浓度木薯适应性培养及比较生长分析后，使用比色试纸检测氰化物水平并观察显色情况。离心后收集生物量用于后续分析。在完全避光培养条件下，以每升30克加里（garri）浓度培养的菌株其综合生长表现优于较低浓度组。

10至20克/升的较低木薯粉浓度显示出可检测到的生长，但生长水平降低且变异性更大。40至50克/升的较高浓度达到较高的峰值细胞密度，但稳定化时间延迟，且变异性更大。台盼蓝排斥实验表明，在30克/升木薯粉浓度下培养的细胞在各个取样时间点均保持较高的存活率。

较高浓度的木薯粉显示出细胞活力短暂下降，随后随着时间推移出现部分恢复，但变异性增加。阳性结果包括细胞呈圆形或半贴壁状态，运动性降低，并在多次传代培养中保持完整。适应后的 E. gracilis 菌株在多种底物上均表现出可重复的生长特性，且相较于野生型菌株更早达到稳定状态，晚期活力下降程度减轻。

成功实施该方案后，通过外部实验室采用燃烧杜马斯法进行定量分析，获得了具有可测粗蛋白含量的纤细裸藻（E. gracilis）生物量。在适应性培养物中观察到的蛋白质百分比与野生型培养物中测得的结果相当，且总蛋白产量的增加与生物量积累的提升相对应。本方案使研究人员能够在不同木薯基环境中研究裸藻的生长、氰化物降解、生物量生产及营养潜力。

本方案的关键挑战在于维持稳定的温度、一致的培养条件以及适合眼虫生长的平衡微生物群落。未来的研究可进一步优化并扩大本方案的规模，提高蛋白质产量，并利用不同类型的木薯废料在大规模条件下测试多种工业应用。