一种培养胚胎期 C. elegans 细胞的方法

本实验的总体目标是分离并体外培养海兔的胚胎细胞。首先需大量培养成年海兔，随后从成体中分离卵子。

然后用壳多糖酶处理卵子以溶解卵壳。最后，通过手工解离细胞并进行培养接种。最终，可通过免疫荧光、显微镜观察、膜片钳电生理记录和钙成像等技术获得结果显示细胞特异性标志物的表达情况。

演示该实验操作的是马尔实验室的博士后 rel ti。在按照文本方案培养至少四块秀丽隐杆线虫至成虫阶段，并准备好培养基和溶液后，开始进行卵的分离：首先解冻一管预先配制好的花生凝集素储备液。

将高压灭菌的盖玻片放入24孔板的孔中，每孔加入200 µL花生凝集素，于室温孵育至少1小时。随后吸除溶液，用无菌水洗涤各孔，彻底去除花生凝集素残留，以防止细胞聚团。

然后使用无菌高压灭菌水将GR成虫从琼脂平板上冲洗下来，并将悬液收集到两个无菌的50毫升锥形管中。将管子置于冰上最多5分钟，使线虫沉降到管底。用移液器吸去上清液，并更换为新鲜的无菌高压灭菌水，于200 ×g离心10分钟。

最后一次洗涤后，用新鲜的无菌水重悬线虫，并转移至无菌的15毫升锥形管中，再以200 G离心10分钟。如果线虫未完全沉淀，将管子置于冰上5分钟。待线虫完全沉降后，吸除上清液，加入5至6毫升裂解液。

然后轻轻摇动悬液5到10分钟，每隔2至3分钟取一滴悬液置于盖玻片上，在体视显微镜下检查裂解情况。当72%至80%的线虫已被裂解时，加入9毫升卵缓冲液终止裂解反应。从此步骤开始，在离心操作期间点燃本生灯并保持燃烧，以防止卵被重新污染。小心移除上清液，并用卵缓冲液将沉淀物彻底洗涤3至4次，直至溶液澄清。接下来，在移除最后一次上清液后，将卵与动物残体分离，将沉淀物重悬于2毫升无菌卵缓冲液中，并加入2毫升含60%蔗糖的卵缓冲液。

离心前将卵充分混匀于溶液中，离心20分钟。在200 G条件下，小心地从离心机中取出试管。卵将漂浮在溶液的顶部。

因此，使用移液器和无菌的1毫升吸头，将卵转移至一个新的无菌15毫升锥形管中。在超净工作台内，用无菌卵缓冲液将卵洗涤三次。为避免引入细菌污染，重悬沉淀的卵于1毫升含2毫克/毫升激酶的溶液中，并将其转移至一个新的15毫升锥形管中。

根据酶的新鲜程度，将试管在室温下轻轻摇动10至30分钟，直至约80%的蛋壳被消化。以900 ×g离心卵子3分钟。小心移除上清液后，加入3 mL L-15培养基，将卵子转移至直径6厘米的培养皿中，并使用带有18号针头的10 mL无菌注射器开始手动解离。

为监测解离程度，取一滴悬液置于新的培养皿中，在显微镜下观察。持续操作直至约80%的细胞完成解离。为去除细胞团块、未消化的卵及已孵化的幼虫，用孔径5微米的滤器轻轻过滤悬液，并额外加入4至5毫升L-15培养基冲洗滤器，以回收细胞用于培养。

将滤液在 900 G 条件下离心 3 分钟后，用完全 L-15 培养基重悬细胞，每孔加入 1 毫升，然后将培养板置于 20 摄氏度、空气环境下的密闭湿润容器中孵育。为了使分离的秀丽隐杆线虫胚胎细胞发生分化，细胞必须首先贴附于基质表面。分化过程通常在接种后约 2 至 3 小时开始，并持续约 24 小时。

体外的形态学特征与体内情况极为相似。例如，如图所示，LM 和 PLM 触觉神经元仅发育出两条神经突，其中一条长于另一条，这与体内的发育特征一致。这表明，驱动秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞分化的分子机制中至少有一部分是细胞自主性的，因此可以在体外重现。

体外培养的蛋白质标记物及细胞特异性的翻译后修饰也可在体外被观察到。例如，α微管蛋白（alpha tubulin）仅在秀丽隐杆线虫的触觉神经元中表达，如图中所示，体外培养的触觉神经元的突起可被抗乙酰化α微管蛋白的抗体染色。此外，如本图所示，体外培养的触觉神经元表达了毒性突变通道MEC-4D，该突变通道在体内会导致触觉神经元的死亡。

从 MEC 四 DPE 4G FP 品系中分离的表达 GFP 的神经元在培养初期存在，但随后发生退化。然而，与体内情况一样，通过 IDE 抑制剂和丹曲林处理可使这些细胞免于死亡，如图所示。采用膜片钳技术研究海兔培养细胞中的钾离子、非选择性离子通道以及多巴胺转运体依赖性通道。

由于细胞体积较小，玻璃移液管必须具有细小的尖端，同时形成较宽的锥形，以抵消输入电阻的增加。此外，通过在移液管尖端下方的膜片上施加高电压脉冲，相较于采用可能损伤细胞的抽吸法获得全细胞记录，能够取得更高的成功率。在本图中，为了研究电压门控钙通道的作用，使用ION four穿透膜，并对表达钙指示蛋白chameleon YC2.12的触觉神经元进行校准，以开展在有或无钙条件下的钙成像研究。

此外，已确定触觉神经元中的游离钙离子平均浓度为 200 纳摩尔。观看本视频后，您应能充分了解如何分离和培养体外秀丽隐杆线虫的胚胎细胞。