利用间接磁珠法分离和鉴定表达podoplanin的间充质干细胞亚群

我们的研究致力于分离特定的间充质干细胞亚群，以实现低成本、高纯度和高可读性的磁珠软化。该方案可使用标准PE标记抗体应用于任何膜蛋白。首先，准备所需的试剂。

选择第3至第5代、融合度达到80%至90%的间充质干细胞（MSCs）。弃去培养基，用10毫升预热的PBS洗涤细胞两次。

轻轻摇动容器，弃去 PBS。加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37°C 下孵育 3 至 5 分钟。在显微镜下观察细胞，直至细胞变圆并开始脱落。

加入4毫升含16.5%胎牛血清（FBS）的培养基以中和胰蛋白酶。轻轻吹打细胞，确保细胞完全脱落，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。在300 ×g下离心3分钟，弃去上清液。

将细胞沉淀重悬于1毫升缓冲液中。计数细胞以确定总细胞数。离心并弃去上清液，操作步骤如前所述。

用缓冲液重悬细胞，使细胞密度达到每毫升1亿个细胞。将细胞悬液转移至5毫升聚苯乙烯圆底管中。每1000万个细胞加入10微升Fc gamma RII阻断剂。

轻柔混匀，室温孵育10分钟。每1000万细胞加入5微升藻红蛋白偶联（PE偶联）抗人podoplanin（PDPN）抗体。轻柔混匀，避光室温孵育15至20分钟。

每1000万个细胞加入10 µL筛选混合液。轻轻混匀，室温孵育15分钟。使用涡旋振荡器剧烈振荡磁珠小瓶30秒。

每1000万个细胞加入5 µL磁珠。轻轻混匀，在室温下孵育10分钟。将含有标记细胞样品的5 mL聚苯乙烯圆底管放入磁力分离架中。

加入缓冲液至离心管中，使总体积达到 2.5 至 3 毫升。在室温下孵育 5 分钟。将磁铁和离心管作为一个整体握住，倒置以将上清液倒入新的收集管中。

将收集的PDPN阴性细胞组分置于冰上。重复磁性分离步骤三次，操作方法如前所述，每次分离后将上清液倒入同一PDPN阴性细胞组分收集管中。最后一次洗涤后，从磁性分离架上取下含有磁性结合的PDPN阳性细胞组分的离心管。

加入三毫升缓冲液以重悬阳性细胞。将阳性组分的细胞悬液转移至新标记的离心管中。分别计数阳性组分和阴性组分离心管中的细胞。

记录每种组分的细胞产量。将阳性组分的细胞悬液在300 g条件下离心3分钟，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于含有16.5% FBS的MEM alpha培养基中。

根据需要调整细胞密度，并将细胞接种至培养板或培养瓶中。在37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养细胞。细胞计数后，以每皿三百万个细胞的密度，将细胞接种至含12毫升培养基的100毫米培养皿中。

接种后24小时，观察细胞贴壁情况。更换新鲜培养基，以去除残留的磁珠和非贴壁细胞。通过胰蛋白酶消化法收集细胞。

轻轻吹打细胞悬液，上下吹打10至15次，以去除磁珠和残留抗体。通过流式细胞术检测PDPN PE阳性细胞的百分比。在对数生长期收集细胞。

将细胞接种至96孔板中。在不同时间点加入Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂，按照生产商说明书测定吸光度。在GraphPad Prism软件中整理分选前与分选后的各时间点数据，点击数据绘制增殖曲线。

在完成FC受体阻断、抗体标记和磁性分选后，PDPN阳性组分的最终细胞数约为350万个细胞，PDPN阴性组分的细胞数约为640万个细胞。磁性分选前，起始细胞群体中PDPN阳性细胞的比例为38.7%；分选后，阳性组分中包含97.9%的PDPN PE阳性细胞。对阴性组分进行流式细胞术分析显示，仍有4.30%的PDPN阳性细胞残留，表明PDPN阳性细胞在阴性组分中被有效耗尽。

连续三天培养的PDPN阳性细胞增殖曲线与未分选的MSCs相比无显著差异，表明该分选策略相较于未分选MSCs，并未引起基于CCK-8法可检测到的增殖能力或代谢活性下降。该方法可使研究者对高纯度且存活率良好的亚群进行研究。本实验方案中最关键的注意事项是操作轻柔，以维持细胞存活率并去除未结合的磁珠。

按照此操作流程，研究人员可进行增殖实验，并开展沉积与脱水研究。