利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

本实验室研究自然杀伤细胞在健康与疾病中的作用，旨在利用其潜力以改进实体瘤和血液系统肿瘤的治疗方案。现有的自然杀伤细胞毒性检测方法在不同平台和实验设置之间缺乏标准化。本方案提供了可重复的活细胞成像和流式细胞术方法，用于准确评估细胞毒性。

首先，在15毫升锥底离心管中，将SYTOX Orange储存液用NK-92培养基稀释，配制10毫升2倍浓度的SYTOX Orange工作液。加入台盼蓝染液混匀后，使用Luna计数仪对靶细胞进行计数，或采用任何经过验证的基于染料排除法的细胞计数方法。将所需数量的靶细胞转移至15毫升锥底离心管中。

将离心管在室温下以300G离心五分钟，弃去上清液。然后将目标细胞重悬于2倍浓度的SYTOX Orange培养基中，调整终浓度为每毫升250,000个细胞。制备效应细胞时，需评估NK-92细胞的活力和浓度，只有当细胞活力高于80%时方可继续实验，因为较低的细胞活力可能影响检测结果。

将所需数量的NK-92细胞计数后转移至若干个15毫升圆锥形离心管中。离心后，重悬细胞至终浓度为每毫升500,000个细胞。为实现效应细胞与靶细胞2:1的比例，取240微升效应细胞加入96孔圆底培养板的孔中作为效应细胞稀释液，其余孔中各加入120微升培养基。

从效靶比2:1开始，进行两倍系列稀释至1:1、0.5:1和0.25:1，每次稀释均需用移液器反复吹打至少五次以充分混匀，并在每次转移时更换吸头。接下来，准备共培养体系，取预先包被多聚赖氨酸的平底96孔板。在细胞转移前立即轻轻重悬靶细胞和效应细胞，避免产生气泡，然后将每种细胞悬液各100 µL加入相应的孔中。

然后，向周围未使用的孔中加入 200 µL PBS。在室温下以 100 × g 离心 2 分钟。将培养板放入活细胞成像系统中。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，每1小时获取一次图像，持续24小时。首次扫描后验证图像质量，并根据需要调整成像参数。调整光谱分离以校正SYTOX Orange在绿色通道中的溢出。

确认橙色阳性死细胞未被误识别为绿色阳性细胞。为配置非贴壁细胞的单细胞分析，将预期目标直径设为15 µm，以匹配细胞的近似直径。将阈值灵敏度和纹理灵敏度设为5，边缘灵敏度设为10，以促进细胞簇的分离。

将接受的对象面积滤波范围设置为 50 至 2,000 平方微米，以排除碎片和较大的物体。将偏心率最大值设置为 0.95，以排除非细胞对象。获取已培养 16 至 24 小时的原代人 NK 细胞。

将500,000个靶细胞转移至一个15毫升圆底离心管中。用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。在室温下以300×g离心5分钟。

然后去除上清液。通过将1微升5毫摩尔的CFSE储备液加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制0.5微摩尔的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）工作液。将获得的细胞沉淀重悬于CFSE溶液中，浓度约为每毫升100万个细胞。

将细胞在 37 摄氏度条件下避光孵育 15 分钟，孵育容器用铝箔包裹以避光。然后加入五到十倍体积的培养基终止反应，并在 37 摄氏度下继续孵育 5 分钟。离心细胞后，将细胞沉淀重悬，调整细胞密度至每毫升 250,000 个细胞，使 100 微升体系中含有 25,000 个细胞。

使用多通道移液器，向圆底96孔板中指定的孔每孔加入100微升靶细胞。每个条件设三个复孔。接下来，用NK细胞培养基为每种检测抗体及相应的同型对照分别配制200微升4倍浓度的抗体溶液。

将抗体溶液转移至深孔板中。向每孔含有靶细胞的孔中加入50微升抗体溶液，并通过上下吹打至少五次充分混匀。向无抗体对照孔中每孔加入50微升自然杀伤细胞培养基，并通过吹打充分混匀。

在标准培养条件下孵育平板25至30分钟。计数并获取200,000个NK细胞，仅当细胞活力大于或等于75%时继续实验。将细胞重悬于800微升人原代NK细胞培养液中，浓度为每毫升250,000个细胞。每孔加入50微升NK细胞悬液至相应孔中，通过上下吹打至少5次充分混匀。

接下来，向对照孔中每孔加入 50 微升培养基，并充分混匀。仔细检查圆底 96 孔板，确认所有孔中液体体积均为 200 微升，弯月面水平一致且无气泡。将板在 100 × g 条件下离心 2 分钟，随后在标准培养条件下孵育 16 至 18 小时。

将培养板在300G条件下离心5分钟，弃去上清液。用荧光激活细胞分选缓冲液（FACS缓冲液）洗涤所有孔，每孔200微升。在FACS缓冲液中配制表面抗体主混合液，配制方案如下所示。

将细胞重悬于每孔50 µL抗体混合液中，通过上下吹打至少五次充分混匀。用铝箔纸包裹微孔板，于4°C避光孵育15分钟。每孔加入150 µL FACS缓冲液。

离心后，将细胞重悬于每孔100 µL含5 µM DAPI的FACS缓冲液中。立即进行流式细胞术检测，无需在上机前进行孵育。使用Cytek Aurora仪器进行流式细胞术检测，并记录CFSE、BV421、BV785、PE-Cy7、DAPI以及任何其他荧光染料的荧光通道信号。

共培养期间，使用实时活细胞显微镜观察效应细胞、活靶细胞和死亡细胞。在效应细胞与靶细胞比例相等的情况下，尤其是早期时间点，CAR2和CAR3-NK-92细胞的杀伤动力学快于CAR1-NK-92细胞。随着效应细胞与靶细胞比例的升高，靶细胞杀伤作用增强，包括表现出天然细胞毒性的对照NK-92细胞。

CAR2 和 CAR3 NK-92 细胞在较低效应细胞与靶细胞比例及较晚时间点表现出更强的效力。而在较早时间点，中等效应细胞与靶细胞比例下亦观察到效力增强。定义了三个参数——KR50、KT50 和 IKI-50，用于量化不同效应细胞群体中 CAR-NK-92 细胞的效力、杀伤动力学及整体细胞毒性能。

单独加入达雷妥尤单抗并未降低靶细胞存活率，证实该抗体在缺乏效应细胞的情况下对靶细胞活力无直接作用。仅与NK细胞共培养可使靶细胞存活率降低至约70%，表明存在基础的自然细胞毒性。加入达雷妥尤单抗后，细胞存活率进一步降低至约37%，与增强的抗体介导细胞毒性作用一致。

相比之下，同型对照组的存活率约为62%，与仅含NK细胞的对照组相当。在未添加抗体的NK细胞与靶细胞共培养条件下，NK细胞脱颗粒水平最低；而在达雷妥尤单抗处理组中，脱颗粒水平最高，约为31%；同型对照组则表现出中等水平的脱颗粒，约为19%。本方案可使研究人员定量评估NK细胞的天然细胞毒性，评价CAR-NK设计对肿瘤细胞的杀伤效力，并比较单克隆抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）效能。实施本方案时的一个关键注意事项是，必须准确且一致地进行细胞计数、移液和NK细胞及靶细胞的铺板操作，以确保获得可靠且可解释的实验结果。

未来的研究可利用这些方案探索自然杀伤细胞的免疫逃逸机制、比较不同肿瘤的易感性，并评估针对多种癌症的新型自然杀伤细胞免疫疗法。