快速 体外 使用荧光成像法评估表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞的细胞毒性
2023年10月27日
一种用于评估表达靶向单一肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR）的Jurkat细胞对肿瘤细胞杀伤能力的定量实验方案。该方案可作为筛选平台，用于在外周血来源的T细胞中验证之前快速优化CAR铰链结构的实验。
CAR T细胞正在不断改进，以在人类临床试验中获得更好的治疗效果。我们正在实验室中探索利用无偏倚的高通量方法评估这些改进策略的途径，例如采用荧光成像技术来筛选最有效的组合方案。通过改变胞外区和铰链区的结构构型，可为任何单链可变区片段设计出多种不同的构建组合。
我们设计了该实验方案，旨在利用Jurkat细胞鉴定在清除靶细胞方面效果最佳的组合。这是一种高通量快速筛选方法，基于CAR构建体对Jurkat细胞的靶细胞毒性进行筛选。当该方法经传统T细胞验证后，可在96孔板中同时检测十余种不同的CAR构建体。在Akhavan实验室，我们采用高通量方式，以绝对数值定量分析表达CAR的Jurkat细胞对靶细胞的直接细胞毒性，从而实现对多种CAR构建体的筛选。
本实验室的主要目标是提高CAR T细胞疗法对高级别脑肿瘤的临床转化效果。我们采用高通量药物筛选作为一种手段，以增强CAR T细胞的细胞毒性，并靶向肿瘤微环境。首先，使用血清移液管，吸除含有70%融合度MDA-MB-231细胞培养物的T75培养瓶中的生长培养基。
向培养瓶中加入 3 毫升胰蛋白酶，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 3 至 5 分钟，使细胞从培养瓶壁脱离。随后加入 3 毫升 DMEM 以中和胰蛋白酶。将细胞悬液收集至离心管中，以 400 ×g 离心 4 分钟。
用移液器弃去上清液，并将沉淀重悬于 2 毫升 PBS 中。使用细胞计数仪测定细胞浓度。将 8 × 10⁵ 个细胞转移至 15 毫升离心管中，并加入 PBS 至终体积为 1 毫升。
然后向离心管中加入两微升 CFSE，使用一毫升移液器充分混匀细胞悬液。将离心管置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育20分钟。接着向管中加入五毫升 DMEM，离心以沉淀 CFSE 标记的细胞。
弃去上清液，并将沉淀重悬于1毫升DMEM中。重新测定细胞浓度后，将4 × 10⁵个细胞转移至25毫升试剂储液槽中。加入DMEM至终体积为8毫升，并用5毫升血清移液管混匀细胞悬液。
使用多通道移液器，将 100 微升细胞悬液加入黑色 96 孔板左侧每行的孔中。同样，将 EGFR 敲除细胞悬液加入该板右侧的各孔中。为确保细胞均匀分布，将板在平台上前后左右轻轻晃动。
将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时，使肿瘤细胞贴壁。根据未转导和表达CAR的Jurkat细胞计数，将4 × 10⁵个CAR-J细胞转移至25毫升储液槽中。向储液槽中加入DMEM，终体积为2毫升。
按照效应细胞与肿瘤细胞4:1的比例，沿孔壁一侧在每孔中加入2 × 10⁴个CAR-J细胞，体积为100 µL培养基，注意不要扰动已贴壁的肿瘤细胞。随后，在含有肿瘤细胞和Jurkat细胞的孔中沿孔壁一侧再加入100 µL DMEM，使每孔总体积达到300 µL。按照演示方式轻柔移动培养板，以确保Jurkat细胞在肿瘤细胞上均匀分布。
将共培养体系置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养48小时。在CAR表达的Jurkat细胞与CFSE标记的肿瘤细胞共培养后，将培养板轻轻倒置在纸巾上并轻敲，以去除含有CAR-J的上清液。使用多通道移液器向各孔中加入100 µL含碘化丙啶（propidium iodine）或PI的FluoroBrite DMEM培养基，注意不要扰动贴壁的肿瘤细胞。
然后向每种肿瘤类型的第一个孔中加入 20 微升 20% Triton X，作为完全裂解对照。将培养板在 37°C 和 5% 二氧化碳条件下孵育 20 分钟，然后进行成像。荧光成像后，使用一个仅含肿瘤细胞的孔来校准绿色荧光通道。
为排除孔边缘的细胞，将孔的掩膜缩小至98%。在绿色荧光通道中识别CFSE标记的肿瘤细胞，并调整荧光强度阈值，以捕获孔内所有细胞。将细胞最小直径设置为25微米，以排除CFSE通道中检测到的碎片。然后启用分离接触对象功能，以识别单个细胞。
接下来，设置门控以区分活细胞与死细胞群体。选择CFSE标记的细胞，并生成一个直方图，纵轴显示细胞计数，横轴显示平均PI荧光强度。调整横轴数值以更清晰地显示细胞分布，并设置分割线以区分低PI染色细胞和高PI染色细胞。
将低PI染色的细胞标记为活细胞。接着，在活细胞上设置另一个直方图，以横轴表示面积，纵轴表示计数。将非碎片细胞标记为大活细胞。
然后使用仅含肿瘤细胞的孔绘制另一个分选器，以捕获细胞并过滤碎片。在对整块板完成分析后，导出包含数据的电子表格。绘制大细胞数量的图表，以确定经 CAR-J 处理后孔中残留的活 CFSE 标记肿瘤细胞数量。
最后，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学分析。CAR-J1 的细胞毒性随着效应细胞与肿瘤细胞比例的升高而增强，在效应细胞与肿瘤细胞比例为4:1时，杀伤率超过50%。针对EGFR的CAR构建体（其铰链区经过修饰）可特异性杀伤表达EGFR的MDA-MB-231细胞，而对EGFR基因敲除细胞则未观察到显著杀伤作用。
CAR 结构也在外周血单个核细胞来源的 CD3 T 细胞上表达。然而，含 CD8 铰链区的 EGFR CAR 未见表达。与 IgG 长型和 IgG 中型相比，IgG 短型对 MDA-MB-231 细胞的细胞毒活性最低。
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概述
本方案概述了一种高通量评估表达CAR的Jurkat细胞对肿瘤细胞毒性的方法。该方法可快速筛选多种CAR结构，以鉴定针对特定肿瘤抗原的最有效组合。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 癌症生物学
- 细胞治疗
背景
- 正在优化CAR T细胞以改善临床效果。
- 高通量筛选方法对于优化CAR结构至关重要。
- Jurkat细胞被用作评估CAR有效性的模型。
- 本研究重点探讨CAR结构对靶细胞的细胞毒性作用。
研究目的
- 建立高效筛选CAR结构的实验方案。
- 定量分析表达CAR的Jurkat细胞的细胞毒性效应。
- 鉴定靶向肿瘤抗原的最佳CAR构型。
使用的方法
- 用于高通量筛选的荧光成像。
- 在96孔板体系中评估多种CAR结构。
- 通过表达CAR的Jurkat细胞定量分析靶细胞杀伤效应。
- 与传统T细胞反应进行比较以验证结果。
主要结果
- 鉴定可有效杀伤肿瘤细胞的CAR结构。
- 利用Jurkat细胞展示高通量筛选能力。
- 对不同CAR结构的细胞毒性进行定量评估。
- 在临床应用前快速优化CAR设计的潜力。
结论
- 该方案可实现对CAR构建体的高效筛选。
- Jurkat细胞为评估CAR功效提供了可靠的模型。
- 该方法可加速CAR T细胞疗法的开发。
常见问题
执行层面的行业相关性
在Jurkat细胞中快速、高通量地评估CAR结构的细胞毒性，可在进行耗时耗力的原代T细胞验证之前，实现CAR设计的早期风险排除与优先级排序。该平台可加速筛选出铰链区优化且靶细胞杀伤能力更强的CAR，有助于在肿瘤细胞治疗研发管线中高效地进行候选分子的筛选与决策。通过同时量化多种CAR结构的细胞毒性，研发团队能够在关键的发现阶段节点上做出基于数据的科学决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够快速检测CAR结构的各种组合，实现功能性靶点验证。
- 通过在受控系统中定量分析直接细胞毒性，支持作用机制层面的风险评估。
- 在原代T细胞工程化之前，有助于提高结构选择的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游高通量筛选工作流程制备经过验证的CAR-Jurkat体系。
- 采用定量荧光成像输出，标准化细胞毒性检测方法。
- 支持并行地对多个CAR结构进行可重复、可扩展的评估。
- 支持在96孔板格式中对化合物或构建体进行可靠评估。
转化与临床前研究
- 通过在PBMC来源的T细胞中验证结果，将早期细胞毒性数据与转化目标保持一致。
- 提供从发现阶段的构建体优化到临床前验证步骤的连续性。
- 通过早期筛选出次优的CAR设计，降低后期失败的风险。
流程与工作流整合
该高通量细胞毒性检测平台位于早期发现与先导化合物鉴定的交汇点，可连接构建体设计与临床前验证。在推进至资源密集型的原代T细胞实验或体内研究之前，该平台能够实现快速假设验证和构建体筛选。
- Discovery Biology：支持对CAR铰链区和胞外结构域修饰在功效方面的假设驱动型评估。
- Screening：提供定量、可重复的细胞毒性数据，用于不同构建体的比较与排序。
- Analytics：提供绝对细胞计数和统计学分析结果（例如单因素方差分析），以支持决策制定。
- Translational Research：在PBMC来源的T细胞中验证构建体的功能表现，支持转化研究的连续性。
- Enterprise Reuse：建立可扩展且可重复使用的平台，用于持续开展CAR构建体优化项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高CAR结构选择的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：标准化并规模化细胞毒性评估，实现资源的高效分配。
- 战略价值：通过早期筛选CAR结构，优化决策流程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的CAR候选分子优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备CAR结构设计和Jurkat细胞慢病毒转导的专业知识。
- 需要具备荧光成像仪器及用于定量读数的分析软件。
- 要求跨团队在实验建立和数据分析参数方面实现标准化。
- 若适配其他细胞模型或抗原，可能需要优化实验方案。
- 依赖于稳健的统计分析（例如，ANOVA）以进行结构间的比较。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
