中性粒细胞分离方案

中性粒细胞分离方案。该操作将从全血样本中提取白细胞，所需设备包括离心机和离心管。涡旋混匀器、移液针头和注射器、注射器滤器。

使用孔径为0.22微米的Millipore品牌滤器过滤材料。Hank平衡盐溶液用于中性粒细胞分离，需要两种HBSS溶液。含氯化钙的HBSS将用于配制人血清白蛋白溶液。

将使用不含氯化钙的HBSS悬浮和洗涤中性粒细胞。请特别注意在本实验步骤中使用正确的HBSS溶液。人血清白蛋白（HSA）是血浆中的一种蛋白质，可维持pH和SMO渗透压。

请勿使用牛血清汞齐红细胞裂解缓冲液。该产品由罗氏诊断公司生产，中性粒细胞分离介质 NIM Cedar Line Labs 淋巴细胞分离液应避光保存，并置于冰箱中以获得最佳效果。所有试剂在使用时应达到室温。

实验前一小时从冰箱中取出试剂。配制用于中性粒细胞分离的H-B-S-S-H-S-A溶液。用移液器将含氯化钙的HBSS加入小瓶中。

将HSA吸入注射器中，避免产生气泡。取下注射器针头，换上滤器。

当其他材料准备就绪并处于室温时，将HSA通过滤器注入HBSS小瓶中，涡旋混匀。采集约15毫升全血，可获得10至15毫升浓度为10⁸的中性粒细胞。供血者在献血样前24小时内不应摄入酒精或非处方药物。

这些因素可能干扰分离过程。全血可使用EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，按九份血液加一份K₃EDTA、枸橼酸钠或肝素处理，具体操作请遵循制造商说明书。以下步骤将在本实验流程中进行描述。

分离并去除血浆和单核细胞。分离并获取中性粒细胞层，首先通过裂解红细胞获得游离的中性粒细胞，进行第一次分离。在NIM层中获取中性粒细胞。

在离心管中加入五毫升分离培养基。将分离培养基置于管底部可使其起到过滤作用，离心时血液将被缓慢压过该层。小心地将五毫升血液叠加在NIM上，以实现清晰分离。

务必小心避免溶液混合。进行此步骤时应缓慢而仔细操作，并将移液枪头靠近分离胶溶液的液面，以防止混合。在500 RCF条件下离心35分钟。

在 20 至 25 摄氏度条件下，血液应分离成六个清晰的条带。这六个条带分别为血浆单核细胞、分离介质、中性粒细胞、更多的分离介质，以及底部的红细胞沉淀。如果这六个条带不清晰或不分明，则说明分离过程不彻底，需要重新进行。

导致分离效果不佳的常见原因包括：供体在过去72小时内饮用过酒精，或服用过泰诺（Tylenol）、阿司匹林等其他药物。仔细移除并丢弃血浆单核细胞层及分离介质。将这些层转移至可密封的离心管中妥善丢弃，然后小心地用移液器将中性粒细胞层以及中性粒细胞层下方的所有分离介质转移至洁净的离心管中，以尽可能回收更多的中性粒细胞。

通常最好同时加入一些下层的分离介质。不要扰动底部的沉淀物。第二次声明，提纯中性粒细胞层。

用不含钙的HBSS将中性粒细胞溶液稀释至10毫升。轻轻颠倒离心管数次以混匀细胞悬液，然后离心中性粒细胞溶液。

350 × g 离心 10 分钟。在 20 至 25 摄氏度条件下，含有中性粒细胞和残余红细胞的离心管底部应出现红色沉淀。用移液器吸走上清液。

小心操作，避免扰动底部的沉淀。裂解红细胞。

现在必须通过裂解破坏样本中的红细胞。为裂解残留的红细胞，向管中加入两毫升红细胞裂解缓冲液以重悬。将沉淀物重悬后，在3至4档的设置下涡旋振荡小瓶。

避免将涡旋振荡器的转速调至4级以上，因为这可能导致中性粒细胞活化。可能需要涡旋数秒或脉冲式涡旋以溶解沉淀物。将裂解液在250 RCF下离心5分钟。

使用软启动选项以尽量减少对样品的损伤。用移液器移除上清液。重复裂解过程。

如有需要，释放中性粒细胞悬液，向每管中加入 500 微升不含钙的 HBSS。在 3 至 4 档涡旋振荡沉淀，用不含钙的 HPSS 稀释至 10 毫升后离心。在 250 ×g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液并弃去。

将沉淀重悬于250微升含HSA的HBSS溶液中，浓度通常为每毫升收集2×10⁶个中性粒细胞。