基于图像的中性粒细胞胞外诱捕网自动化定量分析：采用 NETQUANT 方法

本文介绍了NETQUANT，一种全自动量化NETs和免疫荧光图像的方法。该方法将有助于研究人员对不同用户和实验条件下产生的数据进行可比较的图像分析。该技术的优势在于操作简便、支持单细胞水平的数据分析、具备多种评估NET形成的判据，以及能够对多幅图像进行无偏倚分析。

安装并打开分析软件。最新版本可在 Zenodo GitHub 归档库或 Nordonfelt 实验室网站获取。在设置选项卡中，通过点击源菜单中的“获取路径”选项，选择用于分析的源文件夹。

选择包含待分析图像序列的文件夹。再次点击目标菜单中的“获取路径”选项，并选择用于保存图像分析后数据的目标文件夹。接下来，当使用独立通道图像时，请为通道文件夹命名，使DNA通道对应图像中的细胞核DNA染色，NET通道对应图像中的中性粒细胞弹性蛋白酶染色。

此外，将包含对照图像文件的文件夹命名为 control。然后，单击“加载图像信息”按钮，将图像元数据导入软件中。接着，在通道顺序子菜单中，选择图像中包含的正确通道顺序。

这有助于防止意外的匹配错误。现在点击“准备数据”按钮，以从原始数据中获取主图像属性并转换图像。转换后的图像将显示在样本类型子菜单中。

点击样本类型菜单，从子菜单中选择一幅图像，然后点击“显示图像数据”以分别显示分割为DNA和中性粒细胞胞外诱捕网（NET）通道的图像。为将细胞分割至各自的通道，请选择分割方法选项卡，并在DNA和NET通道的下拉菜单中分别选择一种分割方法。默认的分割方法设置为自适应法，此为推荐设置。

软件中还提供其他选项，包括全局边缘和通道反转。此外，还包含一个分水岭选项，以帮助区分位置相近的细胞或中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。在分割选项卡中，单击“分割对照样本”选项。

然后从样本类型子菜单中选择 PMA，点击批量选项，开始对数据集中包含的所有图像进行分割。接下来，在样本类型菜单中选择图像，点击显示图像数据按钮，以可视化并验证分割后生成的 DNA 和 NET 二值图像掩膜。现在，在分析选项卡中，点击确定阈值按钮，以分析对照样本。

然后，在右侧将样本类型更改为 PMA，并点击“获取细胞特性”按钮，以完成对刺激样本的分析。接下来，从样本类型子菜单中选择一个图像，然后点击“显示图像数据”按钮，以显示图像中的叠加结果、细胞总数以及形成 NET 的细胞数量。首先，从样本类型子菜单中选择相应的样本。

可以从样本类型子菜单中选择单个图像进行分析，或通过选择批量选项来分析整批图像。选择后，点击“分析 NETs”按钮以完成分析。根据特定样本手动调整 NETs 判定标准，以获得最佳分析结果。

将鉴定出的 NETs 与原始图像进行比较，以评估鉴定质量。完成此步骤后，可将 NETs 的鉴定标准应用于数据集中的所有图像。对 NETs 鉴定标准所做的任何修改也将同时应用于所有对照样本。

在细胞数据子菜单中检查数据摘要，其中显示了图像数量、每张图像的细胞计数以及每张图像中NETs所占的百分比。进入输出选项卡以选择并查看结果输出。通过选择输出形式并点击输出结果按钮，浏览并比较由对照样本和PMA处理样本分析生成的各类数据输出。

接下来，打开结果数据表的 CSV 文件以浏览单细胞数据，点击结果 PDF 文件以可视化样本中 NET 区域分布以及 DNA 与 NET 的比值。图中红线表示阈值。最后，点击结果双变量分布文件，以确定 NET 区域与 DNA 形态之间的关系。

在此，对15张对照中性粒细胞图像和15张PMA刺激的中性粒细胞图像进行了分析，耗时不到十分钟。通过本文所述的自动定量方法，统计了细胞总数，并确定了形成中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的细胞百分比。结果显示，与对照样本相比，PMA刺激的中性粒细胞具有更大的面积、更明显的核变形以及更高的DNA与NET比率。

当组合成三维图时，经PMA刺激的样本往往比对照样本显示出更紧密的聚集区域。在进行该操作时，需要注意的是，尽管该工作流程已使用多个供体样本进行过测试，但仍建议用户根据各自的独立数据集适当确定软件参数。