利用显微注射法构建稳定的转基因秀丽隐杆线虫

秀丽线虫是一种极为有用的模式生物，原因在于我们对其细胞谱系已有深入了解，同时其全基因组测序与分析也产生了大量信息。在本视频中，我们将演示将质粒显微注射到秀丽线虫中的过程，并利用荧光显微镜筛选转基因后代。作为一种透明且多细胞的动物，秀丽线虫非常适合在活体中观察表达荧光标记蛋白的转基因。大家好，我叫 Laura Berkowitz，是阿拉巴马大学生物科学系 Caldwell 实验室的一名研究助理。

我是亚当·Knight（Adam Knight），同样来自阿拉巴马大学的Caldwell实验室。今天我将向您展示如何准备并实施纤溶酶微注射，以获得转基因海兔（sea elegance），以及如何筛选和维持转基因海兔品系。现在让我们开始吧。

在开始显微注射之前，我们需要完成一些准备工作，我现在将向您展示这些步骤。首先，准备好待注射的质粒DNA，需要两种质粒：一种编码目的基因的组织特异性表达，另一种提供可筛选的转化标记。将这两种质粒以每微升各50纳克的等量比例混合。

接下来，制备螺口垫片，用于固定线虫以进行显微注射。制备螺口垫片时，首先在实验台面上放置数片22 mm × 50 mm的盖玻片。使用移液管吸取一滴融化的2%琼脂糖，滴加在一片盖玻片上，随即以90度角将另一片盖玻片覆盖在液滴之上。

让气凝胶静置数秒使其固化，然后移除顶部的盖玻片。气凝胶压平后的圆盘直径应在15至20毫米之间。如同照料宠物一般，让该垫材在空气中彻底干燥数小时或过夜。

干燥后，将垫片存放在盖玻片盒中，于室温下保存。接下来，准备用于DNA溶液的上样针。操作时，取一支100 µL毛细管，将其置于明火中部加热，然后迅速拉伸至原长度的约两倍。

毛细管冷却后，将其两端折断分开。准备10至20个针头装载管用于注射。可将其直立存放于微量离心管中。

Brack，小心。进样针的针尖非常锋利。现在开始制备显微注射针。

这些针由一种特殊的毛细管制成，管内含有玻璃丝。该玻璃丝可作为DNA溶液的灯芯。制作针时，我们使用Niki PP eight 30 Polar拉针仪，设定加热温度为24.8，可同时制备多根针以供储存。

可将多根针固定在一条造型粘土上。使用盖玻片的小碎片来打开拉制的针尖。这些碎片的制备方法是：用无尘纸包裹一块18×18毫米的盖玻片，轻轻施压，使其破裂成若干小片。

使用大小约为 3 × 4 毫米的载片。除了准备 DNA 和微针外，还需准备约 50 至 100 个发育阶段合适的线虫，每种表达载体构建体需准备两个野生型线虫用于显微注射。

现在我们准备设置显微注射显微镜。开始设置显微镜时，打开连接到显微注射针臂和持针器的氦气瓶主阀。关闭调节阀，使气体进入管路。

将压力升至35 PSI后，可通过脚踏板释放气体。接下来，将一个针式装载器插入标准口径的移液管管路中，并滴加约一微升的质粒混合物。然后，轻柔地将装载器完全插入显微注射针头，直至感到阻力为止。

轻轻吹气排出DNA溶液，然后取下加样器。DNA加样完成后，将注射针插入显微注射臂，注意将其置于内部小型橡胶垫圈内，再将其夹紧固定在操纵臂上。接着，将一片盖玻片的碎片放在螺旋垫的一侧边缘处。

用空心碳油覆盖碎片以及螺旋垫的整个表面。然后将螺旋垫放置在倒置显微镜的载物台上。待螺旋垫就位后，使用Forex物镜和明场照明，将针尖置于视野中央，但暂不将其降入油中。

接下来，将盖玻片碎片的内边缘置于中心位置，然后对其聚焦。将针头下放至油中，使其与盖玻片碎片处于同一焦平面。通过切换至40倍物镜提高放大倍数，然后重新聚焦于盖玻片碎片的边缘，并在必要时调整针尖位置。

现在将注射针的针尖折断打开。轻轻将针头抵住盖玻片碎片的边缘，同时通过脚踏板施加一个短暂的气体脉冲。针尖即可被充分打开。

当液体的小液滴从针尖逸出时，由于过量液体流动，过大的开口是不可取的，因为它会杀死动物。针头准备好后，我们开始显微注射。接下来，通过将针头向上抬起，从载物台上移除螺杆垫片。

但不要改变 X 轴或 Y 轴的位置。将载物台从针头下方滑出。取下螺旋垫片，将其放置到解剖显微镜上。

将线虫转移至油面下方的加样垫上。若线虫轻微扭动，可轻轻触碰使其接触加样垫，湿润的线虫应会黏附于干燥的加样垫上。迅速将加样垫放回载物台，使线虫位于视野中央。

然后将针头降至与线虫相同的焦平面。切换倒置显微镜的滤光片至霍夫曼（Hoffman）照明模式。该对比度滤光片可使线虫的形态细节变得可见。

使用40倍物镜，聚焦于线虫性腺中位于生殖细胞核蜂窝状结构下方的颗粒状感觉中心。选择位于线虫朝向显微操作针一侧的性腺。微调显微操作针的位置，直至针尖也处于焦点范围内。

轻轻将针插入性腺中心，并施加短暂的气体压力脉冲，将一两滴 DNA 液滴注入性腺臂中。经过大量练习和熟练操作后，您应能观察到液体波纹扩散至远端性腺。每次均可准确命中性腺中心。

请注意，注射线虫时操作应迅速，因为线虫容易脱水。整个过程理想情况下应少于一到两分钟。

注射完成后，将进样垫从载物台上取下并置于解剖显微镜下。将一微升 M9 缓冲液直接加到已注射的线虫上。此操作可能需要将移液器吸头浸入卤代烷油的液面以下。

缓冲液应使线虫重新水化，随后线虫会从气溶胶垫表面漂浮起来，使用线虫挑取工具将线虫转移至普通培养皿。现在我将把注射后的线虫交给Adam，他将向我们展示转基因品系的筛选与维持过程。将注射后的线虫分别转移到新鲜涂布的60毫米培养皿中，使其繁殖后代。

这些蠕虫代表 P0 代。通常将注射后的动物在 20 摄氏度下培养两到三天，直至后代出现。一旦后代出现，我们即可开始筛选转基因蠕虫。

观察F1代子代，以确认转基因标记的存在。在此情况下，筛选标记具有荧光性，因此可使用荧光体视显微镜进行筛选。每只带有荧光标记的F1代个体需分别接种至新的培养板上。

注射的P零代可能在所有F1代中仅产生一到五条荧光后代。让F1代雌雄同体在20摄氏度下繁殖两到三天，直至后代出现。一旦F2代准备就绪，也需对其进行观察以筛选转基因个体。那些继承并表达转基因标记的F2代个体被视为稳定品系。

每个独立的稳定品系应作为单独的线虫品系进行维持，在每一代通过将若干转基因个体转移至新培养板来扩增每个品系。此操作必须使用荧光体视显微镜完成。若筛选标记为荧光蛋白，为控制基因拷贝数的变异，每种注射的构建体应至少建立三个独立的稳定品系。

我们刚刚向您展示了如何进行显微注射表达载体构建体，以及如何筛选稳定的转基因品系。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。