秀丽隐杆线虫突触传递突变体的药理学表征范式

大家好，我是来自阿拉巴马大学生物科学系Caldwell实验室的Cody Locke。我是Kyle Lee，我将向大家展示如何准备线虫用于百草枯和PTZ暴露实验。我是Bernard Tu，我将为大家演示如何进行百草枯实验。

我是Kaylin Berry，负责海兔优雅视频的制作。在本次演示中，我将讲解本展示内容并示范PTZ暴露实验。今天，我和我的同事们将展示如何利用PTZ和戊四氮（Aldecarb）处理后的小鼠癫痫海兔优雅模型，结合一系列代表性突变品系，对突触传递突变体进行表型表征。

那么，让我们开始吧。今天由 Kyle Lee 首先演示在实验第一天如何准备 ALD 糖原测定。确保在第二天进行 ALD 糖原测定时，每种基因型及每个重复组至少有 30 条处于年轻成虫阶段的线虫可用。

最好由实验人员挑选50只或更多L4四期的线虫，转移到含有大肠杆菌OP50作为食物来源的新鲜无杀菌剂NGM平板上。将线虫在恒定且适宜的温度下培养12至24小时。最佳温度为20°C至22°C，尽管25°C也可接受。

第二天，配制 100 毫摩尔/升的 Al Decarb 储存液，并用 70% 乙醇将适量 Al Decarb 均匀涂布于 NGM 平板上。我们通常使用 0.5 毫摩尔/升的 Al Decarb，方法是在含有 7.5 毫升 NGM 培养基的 60 毫米无通风培养皿中加入 37.5 微升 100 毫摩尔/升的 Al Decarb。将 Al Decarb 平板在室温下干燥约 30 至 60 分钟。

平板干燥后无需敲击盖子。将等量的大肠杆菌加到每个醛类碳源平板的中心，再干燥30至60分钟。在室温下，我们通常加入25 µL的大肠杆菌OP50。

50 微升的 OP 50 可形成足够大小的食物草坪，使线虫保持在培养皿中心较小的区域，避免过度拥挤。待食物草坪干燥后，即可进行 alba 碳青霉烯类抗生素检测。由于 ALD 碳青霉烯类抗生素检测具有主观性，强烈建议实验以盲法方式进行。

为此，主要实验者的同事应对含有待检测线虫的原始培养皿进行重新标记，或在启动计时前立即将线虫从原始培养皿转移至加密标记的培养皿中。完成培养皿标记后，ABO 将开始分析，首先统计瘫痪线虫的数量。

定义急性醛脱羧诱导的麻痹主要有两种方法。第一种方法通过咽部泵吸运动的停止来定义麻痹。在本视频说明中，可见一个深色结构，位于屏幕右侧线虫咽部腔内。

这一结构被称为研磨器，通过胆碱能机制进行节律性收缩。该线虫在此视频中的运动因Al Decarb暴露而显著减慢，但其咽部研磨器仍明显在运动。

因此，该线虫并非因泵动停止这一定义而表现为麻痹。在本视频中应观察到，位于屏幕右侧的咽部研磨器并未随着泵动停止而收缩，这符合al Decarb诱导麻痹的工作定义。该线虫应被记分为麻痹状态。

然而，与前一个视频中的线虫一样，这条线虫也表现出轻微的左右觅食运动。尽管其运动能力因Al Decarb处理而受损，但这些运动将导致实验人员无法根据第二种定义方式——即全身不动且对触碰无反应——判定该线虫处于Al Decarb诱导的瘫痪状态。第二种定义Al Decarb诱导瘫痪的方法包括：持续使用铂金丝触碰每条线虫，并检查其是否产生反应。

如果肉眼无法观察到身体运动，我们首选的方法是每隔30分钟用探针刺激蠕虫头部两次、尾部两次，持续三小时。正如您所见，本视频中的蠕虫并未表现出明显的躯体运动。然而，由于该蠕虫在受到刺激时能够明显移动其尾部，因此我们不将其判定为瘫痪。

根据第二种定义，该线虫因脱羧作用诱导而出现麻痹。与上一个视频中的线虫类似，这条线虫没有明显的身体运动，因此需要进行探针刺激测试。然而，与上一个视频中的线虫不同的是，这条线虫对探针刺激没有明显反应。

因此，该线虫符合丙烯双胺诱导麻痹的第二种定义。尽管线虫是否因丙烯双胺而麻痹的差异可能较为细微，但实验人员只需观察大量从平板转移至丙烯双胺平板后立即暴露于该药物的代表性线虫，便应能够识别出显著的运动障碍和突触传递异常。野生型线虫仍可移动。

在本视频中，您将看到与上一个视频相同的野生型蠕虫，在经过一小时的Al Decarb处理后的情况。请注意，蠕虫的运动速度在一定程度上减慢，但仍然明显可见其活动。

与野生型蠕虫不同，本视频中的tomasin-1突变体在暴露一小时后完全无法移动或几乎不移动。该结果与tomasin-1突变体因无法负向调控神经肌肉接头处的神经递质释放而导致乙酰胆碱过度分泌的现象一致：神经肌肉接头突触间隙中过量的乙酰胆碱，结合乙酰胆碱降解受抑制，使tomasin-1突变体表现出高度敏感性。尽管本视频未展示，但已有研究推测，在on-43功能缺失等位基因的醛羧酯酶（aldecarb）检测中也会出现类似结果；on-43编码秀丽隐杆线虫（C. elegans）中钙调蛋白依赖性蛋白激酶2（CaMKII）的直系同源物。本视频展示的是on-25突变体，其抑制性GABA能传递存在缺陷。

暴露于丙烯醛一小时后，这些突变体与 tomasin one 和 M43 突变体相似，均表现出显著的丙烯醛诱导的运动能力障碍，且相较于野生型线虫在相同暴露时间下对丙烯醛的反应更为明显。该结果与M25突变体的表现一致：由于丙烯醛暴露与GABA能传递减弱的共同作用，导致CL ELs神经肌肉接头处兴奋性与抑制性传递比率升高，从而引发体壁肌肉过度兴奋并最终导致瘫痪。然而，由于tomasin one on43和on25突变体在此时间点对丙烯醛表现出相似的敏感性。

尽管体壁肌肉过度兴奋的原因不同，但实验者若不了解致病突变的具体身份，便无法知晓其超敏反应的潜在机制。在本视频中，我们在ALD carb检测的终点——即经醛羰（alde carb）暴露三小时后——重新观察了此前视频中相同的野生型线虫，此时应能清楚地看到，这些野生型线虫尽管基因型正常，却已完全无法活动或仅能轻微移动。这些线虫现在的表型与暴露于醛羰一小时后的TOM one和M 25突变体相似，推测是因为兴奋性胆碱能传递已达到相近水平；相比之下，野生型线虫中的Synap Bren one突变体在暴露于醛羰三小时后仍保持较明显的活动能力。

该结果与 Synaptive Bren one 突变体一致：在相同浓度的 alde carb 暴露下，此类突变体缺乏正常水平的神经递质分泌，其体壁肌肉的胆碱能刺激作用低于野生型蠕虫。Point on four 突变体在胆碱能传递方面存在特异性缺陷，其对 Al Decarb 的敏感性应与 Synaptive Bren one 突变体相似。相反，Tomasin one 和 O 25 超敏感突变体仍保持麻痹状态，与野生型蠕虫无异。

值得注意的是，一些线虫，尤其是对 Al Decarb 具有抗性的线虫，可能会试图爬离培养板。在此情况下，实验人员可涂布一定量的棕榈酸作为物理屏障，以阻止线虫移动。在 Al Decarb 培养板周围，我们涂布了 25 µL 浓度为每毫升乙醇含 10 mg 棕榈酸的溶液。

至此，Al Decarb 暴露方案已完成。接下来，我将演示 Penta Lean Terazol 暴露方案。Kaylin Berry 将协助我们进行 PTZ 检测。

PTZ实验的线虫制备方法与醛卡宾实验基本相同。两者之间唯一显著差异如下：PTZ实验中使用双蒸水（DDH₂O）作为溶剂，而非70%乙醇。

此外，由于我们通常在PTZ上接种的体积大于ALDE carb，因此在添加OP 50之前，需让平板干燥至少一小时。棕榈酸也可与PTZ一同使用。另外，需要注意的是，PTZ的稳定性远低于alde carb，必须在零下20摄氏度保存。

开始分析时，每30分钟统计一次出现癫痫样光惊厥的线虫数量，总计观察一小时。最好将不同类型的惊厥分别归类计数，例如全身性惊厥、前部惊厥（我们称之为“点头”）、前部惊厥伴随体壁肌麻痹（我们称之为强直-阵挛性惊厥），以及全身麻痹（我们称之为强直性惊厥）。如右图所示的线虫，其表现出的类似癫痫的活动通常继发于如左图线虫所示的强直-阵挛性惊厥之后。

类似癫痫发作的活动可能仅仅是重复强直-阵挛性抽搐后肌肉疲劳的结果。然而，我们尚未发表的数据表明，某些蠕虫在PTZ作用下可出现强直状态，其表现类似于脱羧诱导的瘫痪，且并未经历先前的强直-阵挛过程。本文展示了一只典型的突触传递缺陷突变型蠕虫在无PTZ情况下的爬行行为。PTZ是一种GABA受体拮抗剂，在多种动物癫痫模型中常用于诱导癫痫发作。

请注意，该蠕虫在觅食时，其头部或前端正在左右摆动。在本视频中，我们展示了来自同一突触传递突变株的另一条蠕虫，该菌株在上一个视频中已使用。请注意，这条蠕虫处于每毫升水中含有 2.5 毫克 PTZ 的环境中，在觅食时大部分时间仍持续进行头部的左右运动。

然而，这种线虫偶尔会停止左右觅食，转而重复地将身体前端向前推进。最后，应观察在每毫升水中含有10毫克PTZ的情况下，携带与前两个视频中线虫相同突变的个体。请注意，该线虫的左右觅食行为减少，并且其身体前端向前推进的频率和强度均高于较低浓度PTZ条件下的表现。

这些结果表明PTZ具有剂量依赖性，我们在所有对PTZ敏感的突触传递突变体中均观察到这一现象。重要的是，PTZ暴露本身不足以在野生型线虫中诱导类似癫痫的抽搐。同样，我们曾尝试在乙酰胆碱传递存在特定缺陷的线虫（例如on four突变体）或乙酰胆碱传递过度的线虫（例如tomasin one突变体）中诱导PTZ引发的类似癫痫的抽搐，但均未观察到该现象。

因此，根据其对PTZ的相对敏感性，有可能进一步区分出具有乙醛羰基抵抗性的突触传递突变体，究竟是存在一般性突触功能缺陷，还是特异性胆碱能传递缺陷。或许令人意外的是，ONC 25强功能缺失突变体在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的抑制性运动神经元中无法检测到GABA表达，却并未表现出如本视频所示的自发性癫痫样抽搐。

在含有每毫升10毫克PTZ的水中，ONC 25突变体表现出强烈的强直-阵挛性惊厥，尽管未显示仅限于前部的惊厥活动；某些运动行为先于ONC 25相关的强直-阵挛性惊厥，且其惊厥表现模拟了synap Bren one突变体的惊厥特征。因此，实验人员不应假设所有抑制性GABA突变体在PTZ存在下均会表现出强直-阵挛性惊厥或密切相关类型的强直样癫痫样活动，尤其需考虑到获得的突变等位基因很可能是功能部分缺失（hypomorphic）的可能性。

现在我们已经证明，抑制性 GABA 突变体对醛卡巴（alde carb）和戊四氮（PTZ）均表现出超敏反应，而缺乏胆碱能传递负调控的突变体仅对醛卡巴超敏，对 PTZ 则表现为正常敏感性。人们可能会好奇 unc-43 功能缺失突变体在 PTZ 处理下的表现，因为它们也像其他突触传递突变体一样对醛卡巴超敏。unc-43 突变体在没有 PTZ 时并不表现出明显的类似癫痫的惊厥，尽管这些突变体确实会出现罕见的、非重复性的自发全身性收缩；然而，在暴露于每毫升水中含有 10 毫克 PTZ 的条件下，unc-43 功能缺失突变体会出现强烈、重复性且呈剂量依赖性的全身惊厥。目前，这些结果尚不明确，但似乎表明 unc-43 在抑制性 GABA 能传递中并不具有特异性作用，或仅在神经递质释放的负调控中发挥作用。

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经系统中，我们刚刚向您展示了如何利用互补的神经刺激剂——胆碱酯酶抑制剂醛羧（alde carb）和 GABA 受体拮抗剂 PTZ（pentylenetetrazol）——来鉴定 CL elgan 突触传递突变体。在采用任一互补药理学实验范式时，请记住，生物体对一种神经刺激剂的敏感程度无法预测其对另一种神经刺激剂的敏感程度。使用醛羧（alde carb）检测有助于区分抑制性 GABA 突变体与普遍突触功能缺陷突变体：前者在 PTZ 处理下出现头部摆动（head Bob），且对醛羧高度敏感；而后者同样在 PTZ 处理下出现头部摆动，但对醛羧具有抗性。此外，应当注意，抑制性 GABA 突变体在 PTZ 处理下表现出头部摆动，而缺乏胆碱能传递负调控的线虫在 PTZ 处理下则表现为野生型表型。

因此，PTZ 检测也可用于区分这两类对戊四氮（Alde carb）均呈高敏感性的突触传递突变体。综上所述，结合使用 PTZ 和戊四氮（Alde carb）检测的方法，可使研究者以单用任一药物无法实现的方式对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的突触传递突变体进行表征。感谢观看，祝您的实验顺利成功。