渗透压回避行为中的Caenorhabditis elegans：两个基因的突触功能——人类NRXN1和NLGN1的同源基因作为自闭症候选基因的研究

大家好，我是 Manuel Ruiz Rubio，来自西班牙科尔多瓦大学遗传学系。我们正在利用秀丽隐杆线虫作为实验工具来研究自闭症，充分利用秀丽隐杆线虫神经系统已被充分表征的优势。我们正在研究这种线虫的突变体，这些突变体影响了与神经突触相关的基因，并且这些基因已被证实与自闭症相关。

Rein Regans 是存在于突触中的膜黏附分子。秀丽隐杆线虫（C. elegans）的头部含有 amphid，这是一种介导线虫对多种刺激（包括渗透压强度）产生反应的感觉器官。amphid 由 12 个感觉双极神经元和一个 INAP 终末效应器组成。

其中两个神经元，即 Name A SH 右和左神经元，在渗透感觉功能中尤为重要，能够检测高渗透强度下的水溶性失衡。本研究采用 Nan River 葡萄酒天空法，测量线虫突变体在突触缺陷中对渗透回避的反应。

为了评估神经元及高渗透压回避行为的生物学意义，我们采用基于4摩尔浓度果糖溶液的方法，检测了野生型C与神经元基因缺陷突变体之间的不同反应。在实验当天，配制含有1%刚果红的4摩尔果糖母液，并在室温下充分溶解。在NGM平板的固体培养基中央，标记一个直径为1厘米的环形区域。

使用 15 微升的 4 摩尔果糖溶液。让果糖在琼脂上浸润约五分钟，实验应以盲法进行。每个菌株对应的平板应由第二位实验人员标记为 S8。

进行SA时使用这些标记，且标记过程无需征询同意。当实验结束约24小时前进行销售时，需挑选每种基因型的L4幼虫各四条，转移至含有大肠杆菌的AFL NGM平板中，并于次日在20°C条件下培养。实验应从年轻成虫阶段开始。

将每种品系的单个线虫放入静止圈内，并逐一观察每只动物对 tic 障碍的反应时间。为获得可靠结果，应对每种品系至少检测 10 只线虫，并至少重复三次独立实验。连续六次避开红色圆环的个体被归类为正常。

在六次尝试内退出环的个体被视为渗透敏感性控制存在缺陷，每次实验必须使用SA Bristol品系，另使用两只动物作为阳性对照，因为它们能够避开环形屏障。对照品系在遇到由4摩尔浓度果糖构成的渗透屏障时会表现出后退行为。神经功能缺陷突变体bombs在应对该类型强度刺激时的行为与此类似。

然而，NEUR 缺陷型突变体无法检测到这种渗透屏障。通过在不同等位基因的 neur 和 nout 双突变体中进行分析，恢复了野生型表型，使其能够响应渗透强度。通过 RNA 干扰饲喂法获得下游线虫，分离含有目标基因对应片段的 e coli HD 11 五号菌株，该菌株已转化 L 44 40 载体。次日将细菌接种至 LBA 或含碳酸盐的平板上进行分离。

挑选一个细菌菌落，接种至LV液体培养基中，在37摄氏度下振荡培养约7小时。取少量该培养物滴加到含有碳酸钙和IPTG的NGM平板上，室温下静置过夜，使细菌生长并启动目标基因片段的表达诱导。

进行RNA干扰实验时，必须使用阳性和非阴性对照。饲喂实验中，阴性对照是相等的。

我使用TL 44 40载体转化了I HT 11五号菌株。阳性对照为ELI HT 11五号细胞，该细胞被含有22号基因序列的L 44 40载体转化。该基因的失活导致颤抖表型，可在无菌显微镜下轻易区分。

第一天。将四只处于L1阶段、在含细菌的NGM PLA培养基上的线虫转移至含有细菌和科威特（Kuwait）的培养皿中，在20摄氏度下放置12小时。此为禁食期。

第二天，将快速生长的年轻成虫转移至接种了表达特定RNA干扰靶基因细菌的培养板上。在20摄氏度下放置约48小时，以获得F1代子代。随后在接下来的两天内，挑选几只F1代成虫转移到另一块接种了相同细菌的培养板上。

从F2代后代中选择并分离年轻的成年个体，进行表型评分，使用布里斯托尔N2野生型菌株，该菌株含有发生共情的细菌。L4440载体在精细操作时出现反向情况。渗透屏障。

以表达秀丽隐杆线虫 neur 基因片段的细菌喂养的布里斯托尔野生型菌株，未能检测到摩尔溶液中的渗透性屏障。然而，neur 缺陷型突变体原本无法感知渗透屏障，但在喂食表达来自秀丽隐杆线虫 nane 基因片段的细菌后，恢复了该能力。在本视频中，我们展示了一种简单的方法，可用于研究影响秀丽隐杆线虫渗透回避反应的基因的作用。

使用果糖甲醛与刚果红形成的环来分析细胞对渗透强度的反应。在缺陷型突变体中，该反应存在缺陷，然而NU突变体在感知渗透胁迫方面并未受损，其反应与野生型菌株相似。本视频显示，携带不同功能缺失等位基因的ing和releasing基因双突变菌株恢复了野生型表型，能够响应渗透强度。

这些观察结果通过RNA干扰和封闭喂养方法得到了证实。通过该方法，当野生型菌株被喂食表达ING基因相应序列的细菌时，其识别渗透屏障的能力受到损害。另一方面，无法感知高浓度果糖溶液的neur缺陷型突变体，在喂食表达NNU基因相应序列的细菌后，恢复了这一行为。

本实验结果显示，n seeing 和 neur 基因可能参与了线虫感觉神经元突触连接的形成，并且它们之间可能存在相互作用，从而影响突触功能。好的，再见，祝您的实验顺利成功。