使用CyDye DIGE Fluor最小染料对细胞表面蛋白进行选择性标记

我叫Maria，目前在瑞典NOS的Y Healthcare工作。细胞表面蛋白通常参与细胞与其环境之间的通讯，因此在研究中备受关注，旨在更深入地了解疾病以及由细胞环境变化引起的其他生物学差异。在本视频中，我将向您展示一种简单的侧向避光细胞表面标记实验方案，您将能够通过该技术直观地富集这些丰度较低的蛋白质，而无需进行物理增强，并研究这些细胞表面蛋白的差异。

如果您对这项技术感兴趣，可以在二维手册中找到更多信息。此外，我们还针对这一特定主题提供了一份应用说明，您可从 job 下载。在上方所示的细胞表面标记实验方案中，您将在细胞仍保持完整时对其进行标记。在标记过程中，染料仅能接触到细胞表面的蛋白质。

标记步骤完成后，对细胞进行分析以验证细胞表面特异性标记。将标记样品分馏为膜蛋白和胞质蛋白，同时平行制备未分馏样品。

作为对比，此分步分析并非必需，但此处进行该操作仅为了证明细胞表面标记方案对细胞表面蛋白具有特异性。我们还进行了标准的全细胞蛋白非特异性标记方案（如下图所示），在标记前对细胞进行裂解，从而使所有细胞内蛋白均可被标记。标记步骤完成后，样品进行二维电泳分析。

采用非酶法使贴壁细胞脱离，以避免消化目标细胞表面蛋白。本方案中使用细胞刮（rubber policeman）进行操作，但也可选用含酶的细胞解离培养基。将细胞悬液按每管五百万至一千万个细胞分装至多个离心管中。随后离心收集细胞，并用pH 7.4的H-P-S-S-P-H缓冲液洗涤，以去除残留的细胞培养成分。

血清蛋白和荧光成分造成的培养基污染可能干扰标记与检测。悬浮生长的细胞在洗涤后直接离心沉淀并清洗，随后在标记步骤中将细胞重悬于 200 微升冰浴标记缓冲液中，缓冲液包含 HPSS（pH 8.5）和 1 摩尔尿素。

为了获得细胞表面蛋白标记的最佳条件，务必检查pH值。在标记前，我们使用600皮摩尔的side-eye标记1000万CHO细胞。side-eye与细胞数量的最佳比例会因细胞类型不同而有所变化。

由于我们尚不清楚细胞表面蛋白质的确切浓度，因此如何确定蛋白质侧向标记的最佳条件可参见《二维电泳原理与方法手册》。将细胞与侧向标记试剂 D floor、最低剂量的试剂在冰上避光孵育 20 分钟。

标记反应完成后，通过加入20微升10毫摩尔的赖氨酸来淬灭未反应的染料。标记的细胞现在用冰冷的HPSS缓冲液（pH 7.4）洗涤两次，以去除多余的染料。因此，在下一步细胞裂解过程中，将不再有游离染料导致非特异性细胞内标记或蛋白质标记。

细胞表面的蛋白质现已标记完毕，细胞经过洗涤后已准备好进行裂解。将上一步洗涤所得沉淀重悬于150微升裂解缓冲液中，缓冲液含有7摩尔尿素、2摩尔硫脲、4% CHAPS、30毫摩尔Tris、5毫摩尔乙酸镁，pH 8.5，置于冰上至少1小时，期间偶尔涡旋震荡。样品现可进行二维分离。

进行电泳的第一步是准备用于再水合的IPD胶条。通过加入与所用胶条pH范围相对应的IPG缓冲液来配制专用的再水合溶液，并将该溶液加入再水合槽的凹槽中。撕去IPG胶条的保护膜，小心地将胶条干燥面朝下放入含有再水合溶液的再水合槽中。

关闭IPG盒的盖子，并在其中对胶条进行过夜复水。在第一维等电聚焦过程中，蛋白质将根据其等电点（pi）进行分离。该步骤使用IPG four three仪器完成。

将复水后的胶条放入加样槽中，并将电极安装在上方。每个样品使用加样帽上样50 µg。我们既可以将未经分级的样品直接上样，也可以先将样品分为膜组分和胞质组分后再进行上样。

关闭盖子以保护荧光样品免受光照。根据建议对仪器进行编程，并过夜运行。使用成年12孔胶灌制大型12% lamby凝胶。

加入Coster置换溶液以避免管路中形成聚合的丙烯酰胺凝胶。凝胶在使用前于室温下静置过夜使其充分聚合。等电聚焦完成后，取出胶条并分两步在含有SDS的缓冲液中进行平衡：首先使用DTT还原半胱氨酸残基中的二硫键，随后用碘乙酰胺进行烷基化处理，以防止丙烯酰胺对巯基的修饰。

将IPG胶条浸入电泳缓冲液中，然后小心地放置在大尺寸二维胶的顶部。为避免胶条与凝胶之间产生气泡，可在上方加入含有溴酚蓝的熔化的2%琼脂糖溶液进行密封。此时，凝胶已准备好进行第二向SDS-PAGE分离。

蛋白质将根据分子量进行分离，该过程使用Tonal Six系统完成。向电泳槽中加入阳极运行缓冲液，插入凝胶，然后向顶部槽室加入阴极运行缓冲液程序。按照推荐条件连接电源，避光运行第二向电泳，时间约为四到五小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。

在第二向电泳结束后，使用夹具将胶板放入台风荧光成像仪中。可同时扫描两块凝胶和三个通道。该双向电泳结果显示样品中膜蛋白具有高分辨率，尽管疏水性蛋白在双向电泳中存在一些已知的检测限制。结果显示出许多新的细胞表面标记点（图中红色所示），而这些位点在标准标记方法（图中绿色所示）中未能被检测到。

这些结果表明，细胞表面标记方案对细胞表面蛋白具有高度特异性。由于仅标记细胞表面蛋白，因此更易于观察，同时避免了高丰度细胞质蛋白的干扰。上方显示了非分馏的膜组分或细胞质组分凝胶的荧光图像。

以下是同一凝胶经银染后的图像。结果显示，胞质蛋白未发生荧光标记，但银染表明凝胶中确实存在蛋白质。结果还显示，未分级样品与膜组分样品具有相似的蛋白点图谱模式，表明在进行二维电泳前无需进行分级处理，这使得本实验方案既简单又便捷。

SI 二、SI 三和 SCI 五显示出相似的标记模式，均适用于细胞表面实验方案。本研究采用这三种侧向进样DI板最小培养基进行饮食实验，以分析CHO细胞在不同时间长度的血清饥饿条件下细胞表面蛋白的差异表达。实验中所有样本的CY二细胞表面样品被混合后作为内参标准使用。

在饥饿期间，可追踪多种细胞表面蛋白的差异性变化。利用细胞表面蛋白分析方案，在制备胶中鉴定蛋白身份时，检测到18种以上采用标准方案未能检出的新型膜蛋白。为便于回溯匹配至分析数据集上的蛋白点，需加入细胞表面样品进行加标。

实验结果表明，该方法能够高分辨率地检测大量细胞表面蛋白。该方案对细胞表面蛋白具有高度特异性，未观察到细胞内蛋白的标记。

与标准方案相比，使用该方法能够检测到更多的细胞表面蛋白，而且正如您所见，该方案操作非常简便。您只需在细胞保持完整的情况下对细胞表面蛋白进行标记，随后无需进行膜组分分离，即可直接进行二维电泳分析。因此，该方案非常适合用于研究细胞表面蛋白及其在D技术下的差异。