通过流式细胞术在体内检测和表征蛋白质自组装

由于缺乏合适的工具，人们对细胞内蛋白质自组装物理基础的理解受到限制。现有方法存在灵敏度低、读数间接、通量有限和/或群体水平分辨率不足等问题。相比之下，我们的检测方法能够以高灵敏度、单细胞分辨率和高通量的方式，在体内直接检测并量化蛋白质自组装的倾向性，且不受蛋白质定位或溶解度的影响。

初次尝试该检测时，为在整个培养板上获得良好的检测信号，可能需要通过一些经验性测试来优化光转换条件。如果流式细胞仪没有为FRET信号和受体信号配备独立的检测滤光片，则该检测的灵敏度可能会受到影响。接下来将与我一同演示实验操作的是细胞分析核心实验室的实验室主管Andrew Box。

为准备用于DAmFRET的酵母培养物，针对每种目标蛋白，将转化后的酵母菌落以三份重复接种于96孔圆底培养板的各个孔中，每孔含200微升适当的非诱导性生长培养基。将酵母细胞在30摄氏度下，以1.5毫米轨道直径、1,200转/分钟的振荡条件下培养16小时。培养结束后，通过离心沉淀酵母细胞，并通过剧烈倒置去除上清液。

加入200 µL适当的诱导培养基，将细胞放回摇床培养箱中继续培养12小时。培养结束后，通过离心和剧烈倒置沉淀酵母细胞，然后加入200 µL新鲜的诱导培养基。随后将细胞在摇动条件下继续孵育额外4小时，以降低自发荧光。

为进行光转化处理，将无盖的培养板置于紫外灯下，紫外灯需配备320至500纳米的滤光片和准直光束器，并将其放置在培养板上方45厘米处。打开光源，在振荡条件下照射25分钟以完成细胞的光转化。对于DAmFRET数据采集，将光转化后的细胞加载至成像流式细胞仪上，该仪器配备非共线的488和561纳米激光器，并通过高圆度和小细胞面积圈选四个单个未出芽细胞。

然后在荧光阳性门内，每样本收集两万至五万个单细胞的数据。分析结束时，使用未进行光转换的 mEos3.1 样本作为纯供体信号，单体 DsRed two 作为纯受体信号来设置补偿。为了获得更高的灵敏度，确保在分析程序中也将 FRET 检测通道设为溢出目标通道。

将AmFRET参数计算为总FRET信号与总FRET受体信号的比值。仅表达荧光蛋白的酵母细胞表现出可忽略的AmFRET，而表达与荧光蛋白融合的稳定同源寡聚体的酵母细胞则表现出均匀的正值AmFRET。通过成像流式细胞术获取的细胞图像显示所有通道中均存在弥散的荧光。

对多个细胞区域的Z轴层扫共聚焦显微镜成像显示，荧光在整个细胞质中均匀分布，未检测到明显的荧光点状聚集。仅表达荧光蛋白或表达荧光蛋白加上人源炎症小体蛋白突变体的酵母细胞，在整个浓度范围内均表现出可忽略的AmFRET信号，表明其不具备自我相互作用能力。相比之下，野生型炎症小体蛋白呈现出DAmFRET分布特征，包含一个AmFRET信号可忽略的群体和一个AmFRET信号较强的群体。

需要注意的是，即使在高浓度下，野生型炎症小体蛋白仍抵抗自组装，仅在少数细胞中转变为自组装形式。这明确表明自组装过程存在成核能垒。荧光成像结果证实，这些细胞群体分别代表仅含有可溶性蛋白或主要含有自组装蛋白的细胞。

事实上，DAmFRET 验证了先前的结构数据，即炎性小体中的点突变会破坏该表达系统所能达到浓度范围内的成核过程。需要注意的是，在缺乏 Caspase-1 表达的哺乳动物细胞中，蛋白质表达谱与在酵母细胞中观察到的结果相似。最需要牢记的关键步骤是光转化。

其他关键步骤包括收集足够数量的、荧光信号未饱和的事件，并正确进行补偿。通过后续的适当生物化学实验、合理诱变以及结构生物学方法，有助于全面阐明自组装的机制。