Drosophila Larven NMJ Dissection
4. Februar 2009
Dieses Protokoll zeigt, wie Sie sezieren Drosophila Larven in Vorbereitung für die Immunhistochemie und / oder die Abbildung der neuromuskulären Synapse.
Dieses Verfahren beginnt damit, dass man eine Larve des dritten Larvenstadiums auf die Präparationsplatte legt. Nadeln werden an den hinteren und vorderen Enden der Larve platziert. Mit einer Schere wird die Larve geöffnet und mit einer Pinzette werden die inneren Organe entfernt.
Schließlich werden an jeder Ecke der Körperwand der Larve vier weitere Nadeln angebracht, um sie während der Fixierung straff zu halten. Hallo, ich bin Jonathan Brent aus dem Labor von Brian McCabe am Department für Physiologie und biophysikalische Wissenschaften am College of Physicians and Surgeons der Columbia University. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Dissektion von Drosophila-Larven und MJ.
Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die synaptische Entwicklung der neuromuskulären Junction zu untersuchen. Beginnen wir also. Bei Drosophila-Larven gibt es 30 Muskeln pro Hemi-Segment, deren Anordnung in der peripheren Körperwand bekannt ist.
Insgesamt innervieren 35 Motoneurone diese Muskeln in einem hochgradig stereotypen Muster. Um die neuromuskuläre Junction oder NMJ zugänglich zu machen, ist es notwendig, jede Larve mit einer geeigneten Dissektion sorgfältig zu präparieren. Die NMJ kann für die Bildgebung mittels Immunhistochemie oder für elektrophysiologische Untersuchungen verwendet werden.
Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie einen Tropfen HL-3.1-Puffer auf eine Dissektionsplatte geben. Der Puffer wird im Voraus hergestellt und auf Eis abgekühlt. Wählen Sie vorsichtig eine wandernde Drittinstar-Larve von der Seite des Gefäßes mit großen Edelstahl-Forceps aus.
Die Bewegung zeigt an, dass die Larve noch nicht in die Verpuppung eingetreten ist. Legen Sie die Larve mit der dorsalen Seite nach oben in den Puffertröpfchen auf der Präparationsplatte. Der kalte Puffer wird die Larve betäuben und sie mit Hilfe einer Pinzette ruhig halten. Platziere einen Mnuchin-Stift zwischen den hinteren Sphären, dann einen zweiten Stift nahe den dunklen Mundhaken, sodass die Larve gestreckt ist und zum Öffnen bereitsteht.
Erstellen Sie mit einer Feder-Schere einen kleinen horizontalen Schnitt in Richtung des hinteren Endes der Larven. Führen Sie eine Klinge der Schere in den Sci ein und führen Sie einen Längsschnitt in Richtung des vorderen Endes der Larve aus. Anschließend führen Sie horizontale Schnitte am vorderen Ende der Larven links und rechts der Nadel durch.
Um Organe wie den Darm zu entfernen, geben Sie mehrere Tropfen HL-3.1-Puffer zum Tier hinzu; der Darm und andere Organe steigen in die Lösung auf und können mit einer Pinzette vom Körper abgezogen werden. Entfernen Sie ebenfalls das Tracheensystem zusammen mit den anderen Organen. Legen Sie nun die inneren Körpermuskeln frei, indem Sie die durch die Schnitte entstandenen Klappen zurückklappen und mit Nadeln fixieren.
Strecken Sie die Körperwände unbedingt horizontal und vertikal auseinander, während Sie die Klappen fixieren. Entfernen Sie alle verbleibenden Organreste und spülen Sie einmal ab.
Indem frischer HL-3,1-Puffer hinzugegeben wird, ist die Larve nun bereit, mit frisch hergestelltem Formaldehyd fixiert zu werden, das in einem XPBS auf 3,5 % verdünnt wurde; die Larven und das Fixativ vollständig eintauchen lassen und 25 Minuten warten. Nach Ablauf der Fixierungszeit die Larven zweimal mit HL-3,1-Puffer jeweils drei Minuten lang waschen. Die Nadeln vorsichtig entfernen und die Larven bei Bedarf in 1,5-ml-Röhrchen mit einem XPBS überführen.
Die Larven können bis zu zwei Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für optimale Ergebnisse sollten die präparierten Larven sofort verwendet werden. Es gibt mehrere wichtige Bestandteile einer korrekt präparierten Drosophila-Larve.
Zunächst ist darauf zu achten, die Muskeln nicht zu beschädigen, insbesondere die Muskeln sechs, sieben und vier. Zweitens muss das Tier richtig ausgestreckt sein. Andernfalls ist die neuromuskuläre Verbindung möglicherweise nicht zugänglich oder unterscheidbar.
Hier sehen Sie eine korrekt präparierte Larve. Die neuromuskuläre Junction ist deutlich sichtbar und das System ist nun bereit für Experimente. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Larve des Ösophagus präpariert, um die neuromuskuläre Junction zu untersuchen.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Muskeln intakt zu lassen. Wenn die Muskeln beschädigt werden, gibt es keine neuromuskulären Junctions, die untersucht werden könnten. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll zeigt, wie man Drosophila-Larven präpariert, um sie für die Immunhistochemie und/oder die Abbildung der neuromuskulären Verbindung vorzubereiten. Das Verfahren beinhaltet ein sorgfältiges Positionieren von Nadeln sowie die Verwendung von Schere und Pinzette, um die Larven für weitere Analysen vorzubereiten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Drosophila-Larven werden häufig in neurobiologischen Studien verwendet.
- Die neuromuskuläre Verbindung ist ein entscheidender Bereich zur Untersuchung der synaptischen Übertragung.
- Einwandfreie Dissektionstechniken sind entscheidend für eine erfolgreiche Bildgebung und Analyse.
- Dieses Protokoll stellt eine standardisierte Methode für die Larvaldissektion bereit.
Zweck der Studie
- Vorbereitung von Drosophila-Larven für die immunhistochemische Analyse.
- Vereinfachung der Bildgebung der neuromuskulären Verbindung.
- Standardisierung von Dissektionsmethoden zur Reproduzierbarkeit in der Forschung.
Verwendete Methoden
- Platzierung der Nadeln zur Stabilisierung der Larven während der Dissektion.
- Verwendung von Scheren, um die Larven zu öffnen.
- Entfernung der inneren Organe mit einer Pinzette.
- Fixierung der Körperwand zu Abbildungszwecken.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Dissektion ermöglicht die klare Visualisierung der neuromuskulären Verbindung.
- Standardisierte Methoden verbessern die Konsistenz zwischen Experimenten.
- Erleichtert weitere Untersuchungen zur synaptischen Funktion und Entwicklung.
- Bietet eine Grundlage für zukünftige Forschung in der Drosophila-Neurobiologie.
Schlussfolgerungen
- Die Dissektion von Drosophila-Larven ist ein entscheidender Schritt für die neurobiologische Forschung.
- Richtige Techniken verbessern die Qualität der immunhistochemischen Analyse.
- Dieses Protokoll stellt eine wertvolle Ressource für Forscher auf diesem Gebiet dar.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die neuromuskuläre Junction (NMJ) der Drosophila-Larve dient als genetisch zugängliches Modell zur Untersuchung der synaptischen Entwicklung und Plastizität und bietet eine hohe Zugänglichkeit sowie Einzelzellauflösung. Dieses Präparationsprotokoll ermöglicht die reproduzierbare Aufbereitung der NMJ für nachgeschaltete Anwendungen wie Bildgebung, Immunhistochemie und Elektrophysiologie und unterstützt so die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase. Durch die Bereitstellung einer standardisierten Methode zur Isolierung und Visualisierung synaptischer Strukturen erhöht das Verfahren das Vorhersagevertrauen bei der neurobiologischen Zielstrukturbeurteilung und der Aufklärung von Signalwegen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die mit synaptischen Funktionen und neurodevelopmentalen Wegen verbunden sind.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch hochpräzise Visualisierung der Innervationsmuster zwischen Motoneuronen und Muskulatur.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Beurteilung genetischer oder pharmakologischer Interventionen hinsichtlich der NMJ-Morphologie und -Funktion.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet standardisierte biologische Systeme für die Wirkstoff-Screening mit konsistenter Zugänglichkeit der neuromuskulären Junction (NMJ) vor.
- Quantitative Auswertung: Ermöglicht die Messung der Anzahl und Größe synaptischer Boutonen sowie der Proteinlokalisation als phänotypische Endpunkte.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die parallele Verarbeitung von Larven für Screening-Kampagnen mit mittlerer Durchsatzleistung.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert konservierte synaptische Mechanismen, die für die Validierung von Zielstrukturen bei neurodegenerativen und neuromuskulären Erkrankungen relevant sind.
- Translationale Kontinuität: Verbindet genetische Befunde aus Drosophila mit der synaptischen Biologie von Säugetieren über konservierte Signalwege.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Ermöglicht die frühe Bewertung der Zielstrukturenbindung und der Modulation von Signalwegen in einem lebenden, intakten System.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Dissektionsworkflow integriert sich in die frühe Entdeckungsphase, indem er Hypothesentests ermöglicht, führt über zur Identifizierung von Leitstrukturen anhand quantifizierbarer synaptischer Phänotypen und unterstützt die präklinische Validierung durch krankheitsrelevante phänotypische Screening-Verfahren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung synaptischer Signalwege und die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch direkte Visualisierung der neuromuskulären Junction (NMJ).
- Screening: Bereitstellung von assaysbereiten Präparationen mit reproduzierbaren strukturellen und fluoreszenten Messwerten zur Evaluierung von Substanzen.
- Analytik: Erzeugung quantitativer morphologischer und immunhistochemischer Daten zur vergleichenden Analyse unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet synaptische Mechanismen in Drosophila mit präklinischen Modellen über konservierte molekulare Signalwege.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung von Neurozielen über mehrere Entdeckungskampagnen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten in synaptischen Studien reduziert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der NMJ-Präparation über verschiedene Labore hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem eine frühe Erkennung synaptischer Toxizität oder Zielinteraktion ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Neurozielen basierend auf funktionellen synaptischen Ergebnissen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila, in Mikrochirurgie und in der Fluoreszenzmikroskopie.
- Benötigt Dissektionsplatten, Insektennadeln, Feder-Scheren, Pinzetten und HL-3,1-Puffer.
- Erfordert die Standardisierung der Nadelspannung und der Pufferbedingungen zwischen verschiedenen Anwendern.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind unterschiedliche Larvenstadien und genetische Hintergründe, die die Muskelintegrität beeinflussen.
- Praktische Einschränkungen bestehen in den Anforderungen an die Feinmotorik und in möglichen Muskelverletzungen bei ungenauer Dissektion.
