Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 ^Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Der axonale Transport kann durch die Visualisierung der segmentalen Nerven der Larve untersucht werden. Eine Drosophila im dritten Larvenstadium. Zunächst wird die Larve präpariert, wobei das zentrale Nervensystem freigelegt wird, ohne die optischen Lappen, das ventrale Ganglion und die segmentalen Nerven zu beschädigen.

Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Lava in Formaldehyd zu fixieren, bevor sie über Nacht mit dem primären Antikörper und anschließend eine Stunde im Dunkeln mit dem sekundären Antikörper inkubiert wird. Danach wird die Lava auf einen Objektträger aufgebracht und axonale Transportdefekte werden untersucht. Die Proteinsublokalisierung und Proteinaufteilung können mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in den axonalen Transport ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme wie Synapsen- und Muskelmorphologie anwendbar. Personen, die mit dieser Methode neu sind, werden in der Regel Schwierigkeiten haben, da es anfangs schwierig ist, diese zulässige Präparation durchzuführen, insbesondere um die segmentalen Nerven des Gehirns und die Muskulatur intakt zu halten. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine einmalige Menge Pufferfixierlösung, eine einmalige Menge PBT und eine 5 %ige BSA-Lösung vor.

Wie in der Tabelle vor der Präparation beschrieben, sammeln Sie ein sauberes Paar Nummer-fünf-Bizeps, ein sauberes Paar gerader Klingen-Fanzangen und Pins, um die Präparation zu beginnen. Verwenden Sie einen Mikrolöffel, um wandernde Dritte-Instar-Larven mit einem bestimmten Genotyp in eine Petrischale zu überführen. Anschließend spülen Sie die Larven durch Spülen in einer mit deionisiertem Wasser gefüllten Petrischale, um jegliche Nahrung zu entfernen.

Platzieren Sie anschließend eine Larve mit der dorsalen Seite nach oben auf die S-Schutzschale. Fixieren Sie die Larve an ihrem vorderen und hinteren Ende. Geben Sie mithilfe einer feinen Schere einen Tropfen des Einmaldispektionspuffers auf die fixierte Larve.

Pinzette die Larve entlang der dorsalen Mittellinie nahe dem hinteren Ende ab. Schneiden Sie mit der Schere die Larvenhaut vom hinteren bis zum vorderen Ende auf. Geben Sie einen Tropfen frisches Ein-Mal-Präparationspuffer auf die präparierte Larve.

Unter Verwendung einer Nadel wird ein lateraler Rand der Kutikula nahe der Mitte der Larve genommen und die Kutikula mit einer weiteren Nadel fixiert. Für den zweiten lateralen Rand der Kutikula werden jeweils zwei Nadeln auf jeder lateralen Seite wie in der Abbildung gezeigt verwendet. Nun werden vorsichtig das Darmgeflecht, die Fettkörper und die Traia entfernt, sodass nur noch das Gehirn mit den beiden optischen Lappen und den ventralen Ganglien übrig bleibt.

Bei angehefteten segmentalen Nerven erfolgen anschließend die Fixierung und die Antikörperfärbung, wobei die Larven an der Wache-Schale befestigt bleiben. Inkubieren Sie die präparierten Larven für 30 Minuten in 50 Mikrolitern Fixansatz. Ersetzen Sie den Fixansatz alle 15 Minuten; anschließend waschen Sie die Larven 30 Minuten lang in 1× PBT aus.

Indem man alle 10 Minuten den Puffer wechselt, ist darauf zu achten, dass die Larven stets in Puffer eingetaucht bleiben. Bereiten Sie die Primärantikörperlösung vor, indem Sie diese in der 5 %igen BSA-Lösung auf die geeignete Konzentration verdünnen. Optimale Konzentrationen variieren je nach Antikörper.

Stellen Sie eine feuchte Kammer her, indem Sie eine Plastikschale mit mit Wasser getränktem Kim-Tuch auskleiden. Ersetzen Sie das letzte Mal PBT.

Spülen Sie mit der vorbereiteten Primärantikörperlösung und inkubieren Sie am folgenden Tag über Nacht in der feuchten Kammer bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die dissezierten Larven 30 Minuten lang in 1× PBT, wobei Sie den Puffer alle 10 Minuten erneuern. Bereiten Sie den Sekundärantikörper vor, indem Sie ihn in der 5 % BSA-Lösung auf die geeignete Konzentration verdünnen.

Und wickeln Sie die Feuchtkammer in Folie ein, da einige sekundäre Antikörper lichtempfindlich sind. Inkubieren Sie die Larven mit der Lösung des sekundären Antikörpers bei 25 Grad Celsius für eine Stunde. Sobald die Inkubation mit dem sekundären Antikörper abgeschlossen ist, spülen Sie die Larven 30 Minuten lang in 1× PBT aus, wobei Sie den Puffer alle 10 Minuten erneuern, und fahren Sie anschließend mit dem Aufbringen und der Visualisierung der präparierten Larven fort, bevor Sie die Larve auf dem Objektträger fixieren.

Bereiten Sie den Objektträger vor, indem Sie zwei vertikale Streifen Nagellack in der Mitte auftragen, mit einem Abstand, der groß genug ist, damit ein Deckglas darauf liegen kann, wie in der Abbildung gezeigt. Lassen Sie den Nagellack vollständig trocknen. Geben Sie einen Tropfen Einbettmedium in den Zwischenraum zwischen den vertikalen Nagellackstreifen auf dem Objektträger, wie auf diesem Bild dargestellt.

Der Objektträger ist nun bereit zur Einbettung. Entnehmen Sie die Larven nach der letzten PBT-Behandlung. Spülen Sie sie ab und entfernen Sie vorsichtig die seitlichen Stifte von einer Larve.

Seien Sie vorsichtig, um die Kutikula nicht zu beschädigen. Entfernen Sie die beiden verbleibenden Nadeln und heben Sie die Larve mit einer Pinzette auf, um sie auf den vorbereiteten Objektträger zu legen. Stellen Sie sicher, dass die Larve nicht umgedreht ist und ventral ausgerichtet liegt.

Platzieren Sie vorsichtig eine Deckglasplatte von der Seite her darauf und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack, wie hier veranschaulicht. Die Larven sind nun bereit, unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht zu werden. Dieses repräsentative Bild zeigt eine Wildtyp-Larve, die mit Antikörpern gegen das synaptische Vesikelprotein Cysteine String Protein gefärbt wurde.

Die segmentalen Nerven von lava sind gleichmäßig angefärbt. Hier wurde ein Motorprotein-Mutant lava mit Antikörpern gegen CSP gefärbt. Die segmentalen Nerven zeigen massive Ansammlungen, die intensiv für CSP anfärben.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die am Gehirn befestigten segmentalen Nerven zu erhalten und die Muskulatur intakt zu lassen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man präpariert. Fixieren Sie ein Immunfärbungspräparat im dritten Stadium und beginnen Sie mit den larvalen segmentalen Nerven, um den axonalen Transport mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops zu untersuchen.