Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Nun, was den Teer-Assay wirklich einzigartig macht, ist die Möglichkeit, antigen-spezifische T-Zellen direkt zu visualisieren. Der Te, der Teer ist der zentrale einzigartige Aspekt unseres Assays. Dieser ist mit einem Amplifikationsschritt gekoppelt, den wir durchführen.

Wir isolieren die T-Zellen und kultivieren sie anschließend in einem Milieu, das die Probe für die T-Zellen anreichert, die uns interessieren. Danach können wir gezielt nur diese Zellen markieren und sie mittels Durchflusszytometrie sichtbar machen. Bei früheren Nachweisen, wie beispielsweise CSFE- oder Proliferationsassays, die bereits seit Jahrzehnten existieren, erhält man lediglich eine allgemeine Gesamtmessung dessen, was in der gesamten T-Zell-Population vor sich geht.

Aber Sie haben Millionen von T-Zellen im Körper, und sie erkennen eine große Vielfalt an Mustern. Wenn Sie Glück haben, findet sich unter zwei bis 300.000 Zellen der Probe möglicherweise genau eine Zelle, nach der Sie suchen. Deshalb enthält dieser Assay Schritte zur Anreicherung.

Und dann, mit einer Testzahl, und da Sie direkt färben, können Sie tatsächlich eine Population sichtbar machen, die weniger als 1 % der Gesamtanzahl der Zellen ausmacht. So können Sie sehr, sehr geringe Unterschiede erkennen und eine ziemlich genaue Anzahl der T-Zellen in dieser Blutprobe bestimmen, also der T-Zellen in diesem Individuum, die Ihr Muster von Interesse erkennen. Doch damit endet es nicht, denn die Tetramere ermöglichen es Ihnen nicht nur, diese T-Zellen zu markieren, sondern sie auch für weitere Analysen zu isolieren.

Und die Tetramere, die Sie verwenden, werden tatsächlich hier am BRI hergestellt, ist das korrekt? Ja. Wir gehören zu einer sehr kleinen Anzahl von Laboren im Land, die erfolgreich Klasse-zwei-Tetramere hergestellt haben. Unser Ziel ist es, diese Reagenzien zu Selbstkosten an alle Labore weiterzugeben, die an der Einführung dieser Technologie interessiert sind.

Was würden Sie als die schwierigsten oder herausforderndsten Aspekte dieses Assays betrachten, wenn es darum geht, ihn in anderen Laboren zu replizieren? Nun, wenn ich darüber nachdenke, gibt es eigentlich zwei: das Kultivieren der T-Zellen. Das ist etwas, das wirklich ein wenig einer Kunst gleicht.

Sie haben fast täglich Entscheidungen zu treffen, ob die Zellen zusätzliche Nährstoffe oder mehr Platz zum Wachsen benötigen. Und der zweite Teil, der meiner Meinung nach für einen unerfahrenen Bediener vermutlich am schwierigsten ist, betrifft die Datenauswertung. Es gilt herauszufinden, welcher Teil des Signals tatsächlich eine positive Reaktion darstellt und welcher Teil lediglich auf physikalische Effekte und Anziehungskräfte zurückzuführen ist.

Und die Tatsache, dass alles in gewissem Maße klebrig ist, ist etwas, das erneut viel Erfahrung erfordert, insbesondere in Situationen, in denen die Gesamtreaktion etwas schwach ausfallen wird. Wie könnte die Information, die Sie mit diesem Test erzeugen, gegenwärtig Patienten zugutekommen? Eines der ersten Kennzeichen, das bei jedem autoimmunen Patienten auftritt, ist eine Art Zusammensetzung von Antikörpern, die spezifisch für diese Erkrankung sind.

Aus den Grundlagen der Immunologie wissen wir, dass, wo immer eine Antikörperantwort auftritt, zuerst immer eine T-Zell-Antwort erfolgt. Wenn wir daher bei risikobehafteten Individuen diesen Anstieg der T-Zell-Aktivität beobachten könnten, der der Bildung von Antikörpern vorausgeht, ließe sich dadurch eine neue Risikostufe definieren oder erkennen, ob Individuen auf dem Weg zur Bildung von Autoantikörpern sind. Dies würde hoffentlich ein Zeitfenster für interventionelle Therapien eröffnen. Dieses Verfahren dient der Reinigung und Expansion antigenspezifischer CD4-positiver T-Zellen und deren Visualisierung mithilfe von Tetrameren, Reagenzien und Geräten in Sicherheitswerkbänken der Klasse II mit laminarer Luftströmung.

Dies wird der primäre Arbeitsbereich für das Verfahren sein. 50-Milliliter-Konischgefäße, Primärgefäße zur PBMC-Isolierung, ein XPBS. Dieses sollte frei von Kalzium und Magnesium sein, Folienpäckchen plus lichtgeschützt in Folie eingewickelt, Pipettierhilfe, CoStar 10-Milliliter-Pipette, Aerosolkölbchen mit 50-Milliliter-Einsätzen zur Verhinderung der Blutkontamination der Zentrifuge.

GS six R Zentrifugen-Transferpipetten, Pasteurpipetten, hämolytische Pufferlösung mit 8,3 Gramm pro Liter Ammoniumchlorid, 1,0 Gramm pro Liter Natriumbicarbonat, 0,04 Gramm pro Liter DI-Natrium-EDTA, Trianschwarz 0,2 %ige Lösung in PBS, Hämocytometer, 15-Milliliter-Konischrohr, Laufpuffer enthaltend PBS, ergänzt mit zwei Millimolar EDTA sowie fünf Gramm pro Liter.

BSA max CD vier Isolationskit zwei von Milin Biotech, EP-Magnetblock von Stem Cell Technologies gekauft. Andere magnetische Zellenanreicherungsplattformen könnten mit gleicher Wirksamkeit verwendet werden. Fünf Milliliter Polypropylenröhrchen, RPMI 1640 ergänzt mit 25 Millimolar HEPES, zur Herstellung von T-Zell-Medium verwendet, gepooltes menschliches Serum zur Supplementierung des T-Zell-Mediums verwendet, Pen-Streptomycin zur Supplementierung des T-Zell-Mediums verwendet, 500 Milliliter 0,22-Mikron-Flaschentopf-Filter, steriles 48-Loch-Plättchen für die in-vitro-Expansionskultur, Schritt 37 Grad CO2-Inkubator, 20 Milligramm pro Milliliter Lösung eines synthetischen Peptids, das das gewünschte Epitop enthält.

Ein 5 ml Polystyrol-FACS-Röhrchen mit Peptid beladener Klasse-II-pMHC-Tetramer wird verwendet, um antigenspezifische T-Zellen zu visualisieren; Antikörper gegen CD3, CD4 und CD25 werden zur Färbung antigenspezifischer T-Zellen verwendet. Kalibrieren Sie einen FACS-Analysator oder ein gleichwertiges Gerät, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen. Stellen Sie alle Materialien und Geräte in Ihrem Arbeitsbereich bereit.

Die folgende Demonstration umfasst die folgenden Schritte: Isolierung von PBMCs, Separation von CD4-positiven T-Zellen, in vitro Expansion von Kulturzellen und Visualisierung von T-Zellen durch TEM oder Färbung. Schritt eins: Isolierung von PBMCs.

Entnehmen Sie eine Blutprobe. Das Blut sollte in Spritzen oder Blutröhrchen gesammelt und im Verhältnis 1:50 mit Heparin antikoaguliert werden, um eine Gerinnung zu verhindern. Rechnen Sie mit einer Ausbeute von etwa einer Million PBMC pro Milliliter Blut. Davon werden etwa 40 % CD4-positive T-Zellen sein.

Geben Sie das Blut in 50-Milliliter-Konischgefäße ab. Jeweils 25 Milliliter Blut pro Gefäß. Mischen Sie das Blut vorsichtig, bevor die ALI-Gerinnung eintritt, um das Plasma zu verteilen.

Gebe PBS hinzu, wodurch das Gesamtvolumen 40 Milliliter erreicht, und unterlege, indem 11 Milliliter der Fiale in das Blutröhrchen eingefügt werden, und entferne vorsichtig die Pipettierhilfe von der Pipette. Die Fiale fließt langsam in den Boden des Röhrchens. Sobald sich der Flüssigkeitsspiegel ausgeglichen hat, entferne die Pipette langsam aus dem Blutröhrchen, verschließe die Blutröhrchen mit den Kappen und bringe sie in die Aerosolkammer der Kanister.

Schließen Sie die Zentrifugenröhrchen fest und zentrifugieren Sie sie 20 Minuten lang mit 900 × g ohne Bremse. Es ist entscheidend, dass am Ende dieser Zentrifugation keine Bremse angewendet wird, da die Bremskraft die Zellschicht nach der Zentrifugation stören würde. Die PBMC sollten eine deutliche weiße Schicht zwischen dem gelben Plasma oben und dem durchsichtigen Fial unten bilden.

Entnehmen Sie vorsichtig die weiße Blutkörperchenschicht mit einer Transferpipette und überführen Sie sie in ein neues Röhrchen. Einige Plasma- und Fial-Anteile können zusammen mit den PBMCs aufgenommen werden, vermeiden Sie jedoch, Anteile der roten Zellschicht aufzusaugen. Typischerweise können in diesem Schritt zwei Blutröhrchen in ein Zellröhrchen kombiniert werden.

Um die Pelletgröße zu vergrößern, geben Sie PBS hinzu, sodass ein Gesamtvolumen von 15 Milliliter erreicht wird, und zentrifugieren Sie bei 500 ×g für 15 Minuten mit niedriger Bremsstufe. Aspirieren Sie die Flüssigkeit aus den Zylindern mithilfe einer Pasteurpipette, wobei darauf geachtet werden muss, die Pellet nicht aufzuwirbeln. Behandeln Sie die Probe mit hämolytischem Puffer, indem Sie fünf bis sechs Milliliter zu jedem Reagenzglas hinzufügen und vorsichtig mischen, um Klumpen zu entfernen. Inkubieren Sie nicht länger als fünf Minuten.

Gebe PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 50 Milliliter aufzufüllen, und zentrifugiere 10 Minuten bei 230 × g. Bei niedriger Abbremsung sind Aerosolbehälter für diese langsameren Zentrifugationsschritte nicht mehr erforderlich. Wasche die Probe zweimal, entferne die Flüssigkeit mittels einer Pasteur-Pipette, fülle das Röhrchen erneut mit PBS auf und zentrifugiere 10 Minuten bei 230 × g, bevor der letzte Waschschritt durchgeführt wird. Entnehme eine Aliquotprobe der resuspendierten Zellen, verdünne sie mit Trypanblau und zähle mithilfe eines Hämozytometers.

Diese Zellanzahl bestimmt die Reagenzvolumina, die bei der T-Zell-Separation verwendet werden. Schritt zwei: Separation der CD4-positiven T-Zellen. Aspirieren Sie die Flüssigkeit und geben Sie Laufpuffer hinzu, um das Gesamtvolumen auf 40 Mikroliter pro 10 Millionen Zellen aufzustocken. Gewöhnlich werden dazu 30 Mikroliter Puffer zuzüglich des restlichen Pelletvolumens benötigt.

Überführen Sie dieses Volumen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Geben Sie den Antikörper-Cocktail aus den CD4-Isolationskits hinzu, 10 Mikroliter pro 10 Millionen Zellen, und stellen Sie das Gefäß 10 Minuten auf Eis. Nehmen Sie das Gefäß vom Eis, entfernen Sie die Kappe und geben Sie 30 Mikroliter Laufpuffer pro 10 Millionen Zellen hinzu.

Fügen Sie magnetische Kügelchen aus dem CD4-Isolationskit hinzu: 20 Mikroliter pro 10 Millionen Zellen in ein Kapillarzentrifugenröhrchen und stellen Sie 15 Minuten auf Eis. Geben Sie 10 Volumina Laufpuffer zum Waschen hinzu und zentrifugieren Sie bei 230 × g für 10 Minuten.

Während des Zentrifugierens richten Sie den Magneten und ein fünf Milliliter Polypropylenröhrchen in Ihrem Arbeitsbereich ein. Aspirieren Sie die Flüssigkeit vom Zellpellet. Geben Sie zwei Milliliter Laufpuffer hinzu und entfernen Sie Klumpen mit einer Transferpipette.

Überführen Sie die Zellen mit derselben Transferpipette in das Fünf-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie es 15 Minuten lang im Magneten. Dekantieren Sie vorsichtig die CD4-positive T-Zell-Fraktion in ein beschriftetes 15-Milliliter-Röhrchen, indem Sie das Magnetgestell umdrehen und alles bis auf den letzten Tropfen abgießen. Geben Sie weitere zwei Milliliter Laufpuffer zum Fünf-Milliliter-Röhrchen hinzu und nehmen Sie es vom Magneten.

Spülen Sie die CD vier negative Zellen vorsichtig von den Wänden des Reaktionsgefäßes ab und überführen Sie sie in ein beschriftetes 15-ml-Gefäß. Geben Sie zwei Milliliter T-Zell-Medium zu jedem Gefäß hinzu. Entnehmen Sie Aliquote zur Zellzählung und zentrifugieren Sie diese bei 230 × g für 10 Minuten.

Verdünnen Sie Zellaliquote mit Trypanblau und zählen Sie mithilfe eines Hämozytometers. Diese Zellzahlen bestimmen die Anzahl der Wells, die für die Expansionskultur verwendet werden. Schritt drei.

Entnehmen Sie anhand der Zellzahlen Flüssigkeit aus der In-vitro-Expansionskultur aus den Pellets der CD4-positiven und CD4-negativen Zellen. Geben Sie Medium zu den CD4-positiven Zellen hinzu, um das Volumen auf 3 Millionen Zellen pro ml einzustellen. Geben Sie Medium zu den CD4-negativen Zellen hinzu, um das Volumen auf 10 Millionen Zellen pro ml einzustellen.

Die Expansionskultur benötigt 3 Millionen CD-vier-negative Zellen pro Vertiefung und zwei bis drei Millionen CD-vier-positive Zellen pro Vertiefung. In der Regel sind die CD-vier-positiven Zellen die limitierende Population. Portionieren Sie die CD-vier-negativen Zellen in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen einer 48-Vertiefungs-Platte.

Durch Zugabe von 300 Mikrolitern an jede Stelle die Platte eine Stunde lang in einen 37-Grad-Inkubator stellen. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator, waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie 500 Mikroliter frisches Medium hinzufügen und vorsichtig 12 bis 20 Mal mit einer Transferpipette auf- und abpipettieren und anschließend die gesamte Flüssigkeit entfernen. Dieser Waschschritt hinterlässt eine Schicht aus adhärenten antigenpräsentierenden Zellen.

Wenn die Waschung abgeschlossen ist, geben Sie gerade so viel Medium hinzu, dass der Boden jedes Wells benetzt ist, etwa 100 Mikroliter. Andernfalls trocknen die anhaftenden Zellen aus. Geben Sie gegebenenfalls zwei bis drei Millionen CD4-positive Zellen zu jedem Well hinzu.

Fügen Sie zusätzliches Medium hinzu, um das Gesamtvolumen in jedem Well auf einen Milliliter aufzufüllen. Geben Sie das gewünschte Peptid zu jedem Well hinzu. Die typische Konzentration für die Stimulation beträgt 10 Mikrogramm pro Milliliter.

Platzieren Sie die Petrischale abschließend sieben Tage lang in einem 37-Grad-Inkubator. Nach sieben Tagen geben Sie an jedem darauf folgenden Tag 50 Mikroliter Hemo IL 2 in jedes Loch.

Überwachen Sie das Zellwachstum mithilfe eines Mikroskops. Füttern Sie Wells, die noch nicht konfluent sind, indem Sie die Hälfte des Mediums entfernen, frisches Medium hinzufügen und 50 Mikroliter IL zugeben. Teilen Sie konfluente Wells, indem Sie die Zellen resuspendieren, die Hälfte der Zellen in ein leeres Well überführen, frisches Medium sowie 50 Mikroliter IL hinzufügen und die Zellen anschließend in den Inkubator zurückbringen. Die expandierenden Zellen sind nach 13 bis 15 Tagen Kultur für die TEER-Färbung bereit.

Schritt vier, Visualisierung von T-Zellen durch Teer-Färbung: Kaufen oder zusammenbauen Sie Tetramere, die zur Peptid-MHC-Kombination passen, die zur Stimulierung der CD4-positiven T-Zellen verwendet wurde. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator.

Ziehen Sie vorsichtig die Hälfte des Mediums von jedem aus. Überführen Sie eine Aliquotprobe von Zellen aus jedem Well, typischerweise 75 µL oder etwa 50.000 Zellen, in ein 5-mL-Polystyrol-Facs-Röhrchen, geben Sie teer typischerweise ein Mikroliter pro 50 Mikroliter Gesamtvolumen hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 °C. Es ist außerdem ratsam, eine zweite Aliquotprobe jedes Wells mit einem nicht passenden teer als negativen Kontrollstamm zu versehen, und die Zellen mit Anti-CD3-, Anti-CD4- und Anti-CD25-Antikörpern zu markieren.

Zusätzliche oder alternative Antikörparkerne können verwendet werden. Verwenden Sie jedoch keine mit PE markierten Antikörper, da dieser Kanal derzeit für die Teems reserviert werden muss. Kennzeichnen Sie außerdem alle Einzelfarben- oder Isotyp-Kontrollen unter Verwendung zusätzlicher Zellen.

Die Antikörper-markierten Zellen 15 bis 30 Minuten bei vier Grad inkubieren. Jedes Röhrchen mit 0,5 bis einem Milliliter Laufpuffer waschen und 10 Minuten bei 230 ×g zentrifugieren. Die Flüssigkeit vorsichtig von den FACS-Röhrchen abgießen, den Durchflusszytometer mit Referenzperlen, Einzelfarben-Kontrollröhrchen, Isotypkontrollen und dergleichen kalibrieren.

Analysieren Sie jedes Reagenzglas mit dem Durchflusszytometer. Die tetrapositiven Zellen sollten eine deutliche Population innerhalb der expandierten CD4-positiven T-Zellen darstellen. Tetrapositive Zellen sind üblicherweise CD25-positiv und oft CD4 hochpositiv.