Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray
20. März 2009
Die cDNA-Microarray PtGen2 war für die Genexpression Studien in loblolly Kiefer entwickelt, P. taeda Und andere Nadelbaumarten. Hier zeigen wir Pre-und Post-Hybridisierung Bearbeitung und Reinigung Techniken, die mit diesem Array verwendet werden, um eine bessere Konsistenz, verringert Artefakte und unteren Hintergründe liefern kann.
Dieses Video wurde von Forschern der Warnell School of Forestry and Natural Resources der University of Georgia erstellt. Der Zweck dieses Schulungsvideos besteht darin, detailliert darzulegen, wie unser LOB Lolly Pine Pt, Gen zwei cDNA-Microarray bearbeitet wird, wobei insbesondere auf das Waschen und die Handhabung des Arrays vor und nach der Hybridisierung geachtet wird. Im Allgemeinen folgen unsere Protokolle den am Institute for Genomic Research TIGR und der Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, entwickelten Verfahren, wo unsere Arrays gedruckt werden.
Wir haben festgestellt, dass eine strengere Aufarbeitung von PT Gen zwei erforderlich ist, um die größtmögliche Konsistenz hinsichtlich der Signalqualitätsuniformität und niedriger Hintergründe zu erreichen. Der erste Schritt ist eine Vorwäsche. Dies führen wir durch, da unser Spottingpuffer einen sehr hohen Salzgehalt aufweist, und diese Vorwäsche ist notwendig, um das Salz zu entfernen.
Die Objektträger werden in einen Objektträgerhalter gegeben und kräftig 15 bis 20 Mal in eine auf 43 Grad vorgewärmte 0,2 %ige SDS-Lösung eingetaucht. Nach dem Waschen der Objektträger in der SDS-Lösung werden sie vorsichtig mit einer Pinzette in ein Copeland-Gefäß mit Prähybridisierungspuffer überführt. Dieser Puffer enthält fünffach konzentrierte XSSC, 0,1 % SDS und 1 % BSA und ist ebenfalls auf 43 Grad erhitzt.
Das Copeland-Gefäß wird mit Parfum abgedeckt und für eine Stunde in einen 43-Grad-Inkubator gestellt. Nach der Prähybridisierung werden die Objektträger in einen Objektträgerbehälter überführt und nacheinander durch fünf Wechsel von entionisiertem Wasser verarbeitet, wobei jeweils 15 bis 20 Mal in jedem Wechsel eingetaucht wird. Abschließend werden die Objektträger in Isopropanol gegeben und fünf- bis sechsmal eingetaucht, bevor sie in einer Chip M Mate-Zentrifuge zur Trocknung zentrifugiert werden.
Nach der Zentrifugation werden die Objektträger mit Druckluft, die durch einen 0,2-Mikron-Filter geleitet wurde, abgeblasen. Anschließend werden sie mit Lifter-Slips überzogen, die ebenfalls mit Druckluft gereinigt wurden, und wir verwenden eine kleine Pipettenspitze, um den Lifter-Slip in die korrekte Position auf dem Objektträger zu bringen.
Nachdem die Heber-Slips positioniert wurden, aber bevor der Hybridisierungspuffer hinzugefügt wird, geben wir 20 Mikroliter einer 100 Millimolar dihi, drei atol enthaltenden Lösung in die Feuchtigkeitsmulden an den Enden der Kammer. Nun sind wir bereit, die Ziel-cDNAs hinzuzufügen, die in Hybridisierungspuffer resuspendiert wurden. Die Pipettenspitze wird an den Rand des Heber-Slips und des Objektträgers gehalten, und die Lösung wird langsam aufpipettiert.
Wir stellten fest, dass die Nutzung des Kapillareffekts zum Beladen der Arrays die größte Konsistenz bietet und die Bildung unerwünschter Blasen erheblich reduziert. Nachdem das Zielmaterial dem Array hinzugefügt wurde, wird die Hybridisierungskammer zusammengesetzt und mit Aluminiumfolie abgedeckt. Anschließend wird die Hybridisierungskammer über Nacht – typischerweise 14 bis 16 Stunden – in ein schüttelndes Wasserbad gestellt.
Das Wasserbad wird auf 48 Grad eingestellt und der Schüttler auf 50 U/min. Es ist außerdem wichtig zu beachten, dass ab dem Zeitpunkt der Zugabe der Hybridisierungslösung bis hin zu allen nachfolgenden Hybridisierungswaschungen die Verfahren unter schwachem Licht durchgeführt werden, um eine Photooxidation zu verhindern. Am folgenden Tag werden die Objektträger aus der Hybridisierungskammer entfernt und in ein Copeland-Gefäß mit Waschlösung Nummer eins gegeben, die zuvor auf 53 Grad vorgewärmt wurde.
Die Objektträger verbleiben etwa eine Minute lang im Copeland-Gefäß, bis die Halterungen abfallen; anschließend werden die Objektträger vorsichtig mit einer Pinzette entfernt und in einen Objektträgerbehälter gegeben, um mit den Waschschritten fortzufahren. Danach werden die Objektträger kräftig etwa 15 bis 20 Mal in einem zweiten Behälter, der ebenfalls Waschlösung Nummer eins bei 53 Grad enthält, eingetaucht. Der Behälter wird dann mit Parafilm abgedeckt und in einen Inkubator mit Luftschüttler bei 53 Grad und 100 U/min gestellt.
Nach der 10-minütigen Inkubation und der Waschlösung Nummer eins werden die Objektträger kräftig 15 bis 20 Mal in einen Behälter mit Waschlösung Nummer zwei getaucht, die sich bei Raumtemperatur im Behälter befindet. Dieser wurde mit Parafilm abgedeckt und erneut 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Schließlich werden die Objektträger aus der Waschlösung Nummer zwei entnommen und kräftig 15 bis 20 Mal in einen Behälter mit Waschlösung Nummer drei getaucht.
Anschließend werden die Objektträger in einen zweiten Behälter mit Waschlösung Nummer drei überführt, der mit Perfil abgedeckt ist, und erneut 10 Minuten lang auf den Schüttler gestellt. Nach der letzten Wäsche zentrifugieren wir die Objektträger bis zur vollständigen Trocknung. Dazu setzen wir eine 15-ml-Falcon-Kappe in ein 50-ml-Konizglas und platzieren die Arrays mit der Barcode-Seite nach unten in das Konizglas.
Die Röhrchen werden anschließend bei Raumtemperatur in einem Schwenkkopfzentrifugenrotor mit 1500 U/min centrifugiert. Nach der Zentrifugation werden die Objektträger in einen zweiten Satz von 50 ml konischen Röhrchen überführt, die mit Aluminiumfolie abgedeckt wurden. Die Röhrchen werden dann mit Stickstoffgas gespült, das durch einen 0,22-Mikron-Filter geleitet wird, und verschlossen, um sie für den Transport oder die Lagerung bis zur Analyse aufzubewahren.
Wir sammeln die Scan-Daten mit einem PerkinElmer Scan Array 5.000. Das Array-Bild wird gerastert und die rohen Scan-Daten werden verarbeitet, wobei die anfängliche Datenanalyse mit der Imaging-Software-Suite von Bio Discovery durchgeführt wird. Anschließend werden die Spot-Signalintensitätsdaten normalisiert, während statistische Analysen mit den BRB Array Tools durchgeführt werden, einem leistungsfähigen und kostenlos verfügbaren statistischen Paket für Microarrays, das vom National Cancer Institute heruntergeladen werden kann.
Weitere statistische Analysen und Suchvorgänge nach Genexpressionsmustern werden mit der Software-Suite Jeep PPAs für Genexpressionsmuster und -analysen durchgeführt. Ein weiteres frei verfügbares webbasiertes Analysepaket. Vielen Dank für das Anschauen unseres Videos zur Verarbeitung des Lob Lolly Pine PT Gen Two Microarrays.
Die folgenden Personen waren für den Inhalt und die Produktion dieses Schulungsvideos verantwortlich.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
In diesem Artikel wird das cDNA-Microarray PtGen2 vorgestellt, das für Genexpressionsstudien in Kiefer (loblolly pine) und anderen Nadelbaumarten entwickelt wurde. Es werden die Handhabung sowie Waschtechniken vor und nach der Hybridisierung beschrieben, um die Konsistenz zu verbessern und Artefakte zu reduzieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genexpressionsanalyse
- Microarray-Technologie
- Pflanzenbiologie
Hintergrund
- cDNA-Mikroarrays sind unerlässlich für die Untersuchung der Genexpression.
- PtGen2 ist speziell für Kiefer und Koniferen konzipiert.
- Die Einhaltung korrekter Handhabungstechniken ist entscheidend für zuverlässige Ergebnisse.
- Ein hoher Salzgehalt im Spotting-Puffer erfordert eine Vorwäsche.
Zweck der Studie
- Zur Verbesserung der Konsistenz von Genexpressionsdaten.
- Zur Verringerung des Hintergrundrauschens in Microarray-Ergebnissen.
- Zur Bereitstellung eines standardisierten Protokolls für Forscher.
Verwendete Methoden
- Vorwaschen, um Salz aus dem Spottingpuffer zu entfernen.
- Stringente Waschtechniken nach der Hybridisierung.
- Vergleich mit Protokollen etablierter Forschungseinrichtungen.
- Beurteilung der Signalqualität und der Hintergrundniveaus.
Hauptergebnisse
- Verbesserte Konsistenz in der Signalqualität beobachtet.
- Niedrigere Hintergrundniveaus mit verfeinerten Techniken erreicht.
- Protokolle zeigten Wirksamkeit in mehreren Experimenten.
- Empfehlungen für zukünftige Studien bereitgestellt.
Schlussfolgerungen
- Verbesserte Handhabungs- und Waschtechniken sind entscheidend für den Erfolg von Microarrays.
- Standardisierte Protokolle können zu zuverlässigeren Genexpressionsdaten führen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um bessere Ergebnisse zu erzielen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll befasst sich mit einer zentralen Herausforderung der Pflanzengenomik: der Erzielung reproduzierbarer Microarray-Daten trotz hochsalzhaltiger Spotting-Puffer, die Artefakte verursachen können. Durch die Standardisierung der Waschschritte vor und nach der Hybridisierung verbessert das Verfahren die Datenkonsistenz und verringert das Hintergrundrauschen, wodurch eine zuverlässige Genexpressions-Profilierung bei Koniferenarten ermöglicht wird. Dies trägt zu Target-Validierungsansätzen in der forstlichen Biotechnologie bei, indem eine klarere Detektion differenziell exprimierter Gene unter experimentellen Bedingungen ermöglicht wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung transkriptioneller Antworten in Nadelholzgeweben und unterstützt die Hypothesenprüfung in Stress- oder Entwicklungsprozessen.
- Operativer Wert: Verringert die technische Variabilität durch Salzartefakte und verbessert die Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte Mikroarrays mit geringem Hintergrund, die für reproduzierbare Hybridisierungen über verschiedene Versuchsgruppen hinweg geeignet sind.
- Operativer Wert: Etabliert einen robusten Workflow zur Herstellung von Objektträgern, der die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit des Assays verbessert.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem zuverlässige Expressionsprofile aus Kieferngeweben bereitgestellt werden, die für die Untersuchung der Anpassung an die Umwelt oder der Holzbildung nützlich sind.
- Operativer Wert: Erleichtert die Vergleichbarkeit zwischen Studien durch konsistente Objektträgeraufbereitung und fördert so die translationale Kontinuität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsbiologie-Arbeitsablauf ein und unterstützt insbesondere eine zuverlässige Target-Profilierung in nicht-modellbasierten Pflanzensystemen, in denen genetische Werkzeuge begrenzt sind.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Ermöglicht die hypothesengeleitete Expressionsanalyse in der Kiefer, wodurch Genantworten in Wurzel-, Nadel- und Stammgeweben geklärt werden.
- Screening: Liefert Microarrays mit einheitlicher Signalqualität und ermöglicht somit zuverlässige vergleichende Untersuchungen der Genexpression unter unterschiedlichen Bedingungen.
- Analytik: Erzeugt saubere, normalisierte Signalamplitudendaten, die mit nachgelagerten Werkzeugen wie BRB Array Tools und JePPAs zur statistischen Analyse kompatibel sind.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Kontinuität von der Genentdeckung bis zur funktionellen Validierung, indem vertrauenswürdige Expressionsgrundwerte bereitgestellt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert ein wiederverwendbares Protokoll zur Herstellung von Objektträgern, das auf mehrere Koniferenarten und experimentelle Ansätze übertragen werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Vorhersagesicherheit bei Genexpressionsmessungen, indem artefakte durch Salz und SDS minimiert werden.
- Operationaler Wert: Steigert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit zwischen Objektträgern und Laboren durch definierte Wasch- und Handhabungsschritte.
- Strategischer Wert: Verringert das Risiko von falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen in der Expressionsprofilierung und unterstützt damit fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen bei der Target-Validierung.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidatengenen auf Grundlage sauberer und zuverlässigerer Expressionsdaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Expertise im Umgang mit Mikroarrays und Hybridisierungstechniken.
- Benötigt Zugang zu temperaturgesteuerten Wasserbädern, Inkubatoren und Zentrifugen für die Aufarbeitung der Objektträger.
- Setzt standardisierte Reagenzien wie SDS, SSC, BSA und Isopropanol für Wasch- und Dehydrierungsschritte voraus.
- Erfordert die Anpassung der Feuchtigkeitskontrolle und der Hybridisierungsdauer je nach Herkunft der Ziel-RNA und Markierungsmethode.
- Praktische Einschränkung: Der hochsalzhaltige Spottingpuffer erfordert eine gründliche Vorwäsche; unvollständige Salzentfernung kann bestehen bleiben, wenn die Schritte verkürzt werden.
