Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Um die Bindungsstellen ribosomaler nukleärer Proteine auf prä-mRNAs abzubilden, beginnen Sie damit, den festgelegten Bereich der gewünschten prä-mRNA in 30-Nukleotid-Fenstern zu überlappen und synthetisieren die überlappenden Oligos auf ein Array. Die Oligos werden vom Array abgekocht und gemeinsam mit einem RNP der Wahl nachpräzipitiert. Der gesamte Startpool wird mit SCI drei markiert und der gebundene Pool mit SCI fünf markiert; beide werden anschließend auf das Detektionsarray aufgetragen.

Das Array wird anschließend gescannt, und eine Software zur Merkmalsextraktion wird verwendet, um die Ergebnisse zu interpretieren. Salze. Hallo, ich bin Kate Watkins aus dem Labor von Will Fairbrother in der MCB-Abteilung der Brown University. Heute zeige ich Ihnen ein schnelles und kostengünstiges Verfahren, um die genaue Position eines RNA-Protein-Komplexes auf prem-RA im Labor zu bestimmen, indem prem-A als Pool überlappender Oligonukleotide neu synthetisiert wird.

Dieser Pool kann anschließend durch eine Ko-Immunpräzipitation in eine gebundene und eine ungebundene Fraktion getrennt und danach mittels eines Mikroarrays analysiert werden. Obwohl dieses Verfahren zahlreiche Anwendungen hat, nutzen wir es, um mehrere Spleißfaktoren sowie deren Rolle bei der alternativen Spleißung zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie den uc SC-Genom-Browser, um bestimmte Gene, Spleißverbindungen oder andere Bereiche von Interesse herunterzuladen, aus denen der premA-Pool entworfen werden soll. Wählen Sie die Bereiche von Interesse aus und kacheln Sie diese computergestützt mit einer Länge von 30 Nukleotiden und einer Überlappung von 20 Nukleotiden so, dass sich jedes Oligo um 10 Nukleotide gegenüber dem vorherigen verschiebt. Sobald die 30 Nukleotide langen Oligos definiert sind, flankieren Sie jedes Oligo mit universellen Primersequenzen.

Reichen Sie die Oligos bei Agilent zur Herstellung eines maßgeschneiderten Oligonukleotid-Mikroarrays ein. Sobald der Mikroarray eintrifft, beginnen Sie mit der Rückgewinnung der DNA-Oligos von seiner Oberfläche, indem Sie die Array-Deckfolie in eine Array-Hybridisierungskammer geben und vorsichtig 500 Mikroliter deionisiertes Wasser auf die Folie pipettieren. Legen Sie die Mikroarray-Folie mit der Oberseite nach unten auf die Deckfolie, sodass sich die Beschriftungen beider Folien gegenüberliegen, und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden, die den Oligo-Rückgewinnungsprozess stören könnten.

Schließen Sie die Hybridisierungskammer und rotieren Sie sie über Nacht bei 99 Grad Celsius in einem Hybridisierungs-Ofen. Am folgenden Tag entfernen Sie das Array vorsichtig aus der Kammer und ziehen das Wasser ab, das nun die von der Array-Oberfläche freigesetzten Oligos enthält. Geben Sie den Pool der freigesetzten Oligos in ein 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen und sonifizieren Sie, um potenzielle Klumpen zu zerstreuen, dreimal mit 50 % Amplitude, jeweils drei bis fünf Sekunden lang. Amplifizieren Sie anschließend den Pool mittels PCR mit geringer Zyklenzahl unter Verwendung universeller Primer, an deren Ende ein T-Promotor angehängt ist.

Die Anzahl der erforderlichen Zyklen kann je nach Effizienz der Oligorückgewinnung variieren. Vermeiden Sie eine Überverstärkung, die sich als verschmierter Band auf einem Acrylamidgel zeigt. Verwenden Sie abschließend das Mega Short Script Kit von Amon zur Transkription von RNA.

Beenden Sie die Transkriptionsreaktion durch Phenol-Chloroform-Extraktion der RNA, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation unter Verwendung von Natriumacetat und Glyco-Blue als Träger. Resuspendieren Sie den RNA-Pellet in 105 Mikrolitern TE-Puffer. Um die Konzentration der RNA genau zu bestimmen.

Verwenden Sie Ribo Green, um eine Standardkurve zu erstellen. Anschließend messen Sie mit einem Fluoreszenz-Plattenreader. Der RNA-Pool ist nun bereit, um die Co-Immunpräzipitation zur Anreicherung zu starten.

Bereiten Sie zuerst die magnetischen Kügelchen vor, indem Sie Protein A- und Protein G-Dynabeads im Verhältnis 1:1 zu einem Endvolumen von 50 Mikroliter pro Reaktion kombinieren. Konzentrieren Sie die Kügelchen an einer Stelle mithilfe eines magnetischen Trennstands, um den Überstand zu entfernen. Anschließend waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einem gleichen Volumen kaltem 1× PBS; nach dem zweiten Waschschritt erfolgt keine weitere Waschung.

Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem gleichen Volumen kaltem 1× PBS und geben Sie zwei Nanogramm des Antikörpers pro Ion hinzu. Diese Menge kann je nach Antikörper variieren, daher kann es erforderlich sein, experimentell die optimalen Bedingungen für die Bindung des Antikörpers an die Kügelchen zu ermitteln. Inkubieren Sie das Gemisch über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform.

Am Morgen zwei Mikrogramm pro Reaktion sonifizierte Hefe-Gesamt-RNA hinzufügen, um unspezifische Bindungen zu blockieren, und weitere 30 Minuten bei vier Grad Celsius rotieren lassen. Sobald der Blockierungsschritt abgeschlossen ist, erneut den Magnetständer verwenden, um den Überstand zu entfernen. Anschließend die Kügelchen zweimal mit kaltem 1× PBS waschen, das PBS aus dem zweiten Waschschritt im Gefäß belassen und 50 Mikroliter der Kügelchenmischung in neue Röhrchen aliquotieren.

Ein Gefäß für jede Co-IP-Reaktion. Die Kügelchen sind nun bereit für die Co-IP. Bereiten Sie als Nächstes den Master-Mix vor, indem Sie den RNA-Oligo-Pool mit nukleärem Zellextrakt kombinieren.

Als RNP-Quelle entnehmen Sie einen 50 Mikroliter großen Aliquot der Master-Mix-Lösung als Gesamtproben-Schutz. Primern, die RNA-Versionen der universellen Primer sind, kann hinzugefügt werden, um die Bindung von Proteinen an die Primersequenz zu verhindern oder um der RNA eine Sekundärstruktur zu verleihen. Um die Co-Immunpräzipitation zu starten, entfernen Sie das Überstandsvolumen von den Bead-Aliquoten und resuspendieren die Beads in 120 Mikrolitern der verbleibenden Master-Mix-Lösung. Inkubieren Sie die Ansätze unter leichtem Schütteln bei vier Grad Celsius für eine bis zwei Stunden.

Am Ende der Inkubation kann ein kleiner Teil der Eloqua, einschließlich der Perlen, aus jedem Co-IP entnommen werden. Für zusätzliche Tests zur Bindungseffizienz oder -spezifität stellen Sie den Rest der Ansätze auf den Magneten und entfernen den Überstand. Anschließend erfolgt ein bis zwei Waschschritte mit kaltem 1×PDS.

Die an das Antikörper auf den Kügelchen über den RNP gebundene RNA ist die IP-Probe. Resuspendieren Sie die IP-Kügelchen in 50 Mikrolitern 1 % SDS in 0,1 XTE-Puffer und erhitzen Sie die Proben 15 Minuten lang auf 65 Grad Celsius. Um die RNA zu eluieren, entfernen Sie den Überstand, der nun die zuvor an die Kügelchen gebundene RNA enthält, und reinigen Sie diese durch Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern 0,1 XTE-Puffer.

Als Nächstes transkribieren Sie die Proben mit den universellen reversen Primern zurück. Anschließend amplifizieren Sie die Proben per PCR mit den universellen Primern, von denen einer einen T-sieben-Promotor enthalten sollte. Die Anzahl der Zyklen, die zur Amplifikation des Pools erforderlich ist, hängt von der Effizienz des Co-IP ab.

Transkribieren Sie die Proben erneut mithilfe des Mega Shorts-Script-Kits von Ambion, fügen Sie diesmal jedoch zwei Mikroliter Aminoallyl-UTP hinzu, anstatt des mitgelieferten T7-UTP. Das Aminoallyl-UTP wird später verwendet, um die RNA mit den Side Eyes zu markieren. Sobald die Transkription abgeschlossen ist.

Phenyl-Chloroform-Extrakt und Ethanol fallen die Proben aus. Verwenden Sie kein Glyco-Blue oder Ammoniumacetat, da diese die Hybridisierung der Proben an das Array stören könnten. Resuspendieren Sie das Pellet in 4,5 Mikrolitern 0,1-molarer Natriumcarbonatlösung.

Um die Proben zunächst zu markieren, geben Sie 2,5 µL nukleasefreies Wasser zur Gesamtprobe hinzu. Geben Sie 3 µL S3 zur IP-Probe und 3 µL SCI fünf hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde lang im Dunkeln.

Beenden Sie die Reaktion bei Raumtemperatur durch Zugabe von sechs Mikrolitern viermolarem Hydroxylamin-HCl zu jeder Probe, mischen Sie gründlich und zentrifugieren Sie. Inkubieren Sie kurz 15 Minuten bei Raumtemperatur und reinigen Sie die markierten Proben durch Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation. Der größte Teil der Farbe wird mit den freien Nukleotiden in die organische Phase gezogen, sodass die Pellets möglicherweise nicht sichtbar gefärbt sind.

Suspendieren Sie jedes Pellet in 50 Mikrolitern 0,1 XTE. Bereiten Sie die Microarray-Probe gemäß den Anweisungen des Agilent-Array-Hybridisierungskits vor, mit der folgenden Ausnahme: Fragmentieren Sie die RNA nicht. Fügen Sie nach Zugabe des Fragmentierungspuffers sofort den Hybridisierungspuffer hinzu, um die Fragmentierung zu stoppen.

Die Proben auf das Array geben und drei Stunden lang bei 50 Grad Celsius hybridisieren, während das Array rotiert. Die folgenden 50 Milliliter-Lösungen in 50 Milliliter-Konischen Röhrchen vorbereiten: ein Röhrchen mit zweifachem SC-Puffer, zwei Röhrchen mit einfachem Seabuffer und ein Röhrchen mit entionisiertem Wasser.

Nach der dreistündigen Inkubation vorsichtig das Array-Objektträger-Sandwich öffnen und in den 2×SSC-Puffer legen. Mit einer Pinzette das Array vorsichtig vom Deckglas trennen.

Entfernen Sie vorsichtig die Deckfolie, wobei darauf zu achten ist, das Array nicht zu berühren. Während die Folie herausgezogen wird, schließen Sie den Kegel und drehen ihn sanft für 60 Sekunden um. Überführen Sie das Array mit der Pinzette in die 1xSSC-Lösung.

Schließen Sie das Röhrchen und drehen Sie es sanft für eine Minute um. Überführen Sie dann das Array in die zweite XSSC-Lösung und drehen Sie es erneut sanft für eine Minute um. Zuletzt überführen Sie das Array in das Röhrchen mit entionisiertem Wasser und drehen Sie es sanft für 30 Sekunden um.

Trocknen Sie das Array, indem Sie die Kanten des Objektträgers auf ein Kim-Tuch legen. Drehen Sie das Array weiterhin auf dem Tuch, wobei Sie sicherstellen müssen, dass die Seite mit den Oligos nicht gestört wird. Legen Sie das Array in ein leeres kegelförmiges Röhrchen und fahren Sie mit dem Scannen des Arrays fort.

Fahren Sie mit dem Scannen des Arrays fort. Hier ist ein repräsentatives Array. Jede Struktur oder jedes Oligo ist entweder grün für den gesamten nicht angereicherten Pool oder rot für den IP-angereicherten Pool eingefärbt.

Das Signal an jeder Stelle wird anhand der Gesamtintensität in diesem Kanal normalisiert. Die endgültige Ausgabe ist das Logarithmusverhältnis des roten Kanals zum grünen Kanal. An jeder Stelle auf dem Array wird der durchschnittliche Wert jeder genomischen Koordinate dem entsprechenden Ort zugeordnet.

Eine Veranschaulichung dieses Mittelungsschritts wird für drei überlappende 30-Nukleotid-Oligos mit Werten von zwei, vier und 0,5 gegeben, wobei der durchschnittliche Anreicherungswert für jedes 10-Nukleotid-Fenster dargestellt ist. Hier ist ein Beispiel eines Bindungsschemas für das poly-perineverfolgende Bindungsprotein PTB an den Genmerkmalen des CLTA-Gens, wobei die Genmerkmale am unteren Rand angegeben sind und die logarithmischen durchschnittlichen Anreicherungswerte für die an PTP gebundenen Sequenzen durch dunkelrote vertikale Balken dargestellt werden. Hellrote Balken zeigen Bereiche an, die keine Anreicherung für die PTP-Bindung aufweisen.

Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man schnell und effizient einen Oligonukleotid-Pool herstellt, der Abschnitte von Interesse, wie alternativ gespleißte Axone, abdeckt. Wir analysieren unsere Pools mittels Microarray, es ist jedoch auch möglich, sie entweder durch Illumina-, 454-Sequenzierung oder durch die traditionellere Sanger-Sequenzierung zu sequenzieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Erstellung des Pools auf Ebene der RNA oder des Proteins modifizierbar ist.

Auf Ebene der RNA können autologe Regionen, Krankheitsmutationen, Polymorphismen oder zufällige Mutationen in die Oligonukleotidsequenz eingefügt werden. Auf Ebene des Proteins kann der RNA-bindende Faktor durch Phosphorylierung oder andere posttranslationale Modifikationen verändert werden. Außerdem kann die Bindungsumgebung so manipuliert werden, dass die Konzentration zusätzlicher Faktoren, die entweder mit dem gewünschten RNA-bindenden Protein konkurrieren oder mit ihm interagieren, erhöht oder verringert wird.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.