Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Dieses Verfahren beginnt mit dem Kultivieren des Bait-Stamms in Medium, das normale Aminosäuren enthält, sowie des SLAC-Kontrollstamms mit schweren lysin- und argininisotopen Aminosäuren. Gleichmäßige Mengen beider Stämme werden gemischt und durch Mahlen in flüssigem Stickstoff lysiert. Die rohen Lysate werden zunächst durch Zentrifugation pelletiert und anschließend durch Bindung an Sphäros-Beads geklärt. Danach wird das Zelllysat an IgG-Beads gebunden.

Die an IgG-Perlen gebundenen Proteine werden durch Protease verdaut, gespalten und präzipitiert. Die Probe ist nun bereit zur Analyse mittels Massenspektrometrie. Hallo, ich bin Jesse Chao aus dem Lone-Labor der Abteilung für Zell- und Umweltbiologie am Life Sciences Institute der University of British Columbia.

Heute stellen wir ein Verfahren für die quantitative proteomische Analyse namens SILAC vor, kombiniert mit Affinitätsreinigung. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Protein-Komplexe zu untersuchen.

Beginnen wir nun. Bei diesem Verfahren enthält der Bait-Stamm normale Aminosäuren, während der SLAC-Kontrollstamm schwer isotope Lysin- und Argininanteile enthält. Zunächst werden jeweils ein Liter des Bait-Stamms und des Kontrollstamms separat bis zum auf Ihrem Bildschirm angezeigten Wert kultiviert. Anschließend wird die Kultur in 500-Milliliter-Nalgene-Zentrifugenröhrchen umgegossen.

Den Belastungsausgleich in pelletierten Zellen bei 2.580 RCF durchführen, das Medium abgießen und das Pellet in 50 Milliliter kaltem DH₂O resuspendieren. Während der Übertragung der Zellen in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen die Röhrchen zentrifugieren, um die Zellen bei 3.000 RCF zu pelletieren. An diesem Punkt kann das Pellet bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Kontrollstammkultur und die Lockstoffstammkultur eins zu eins nach Trockengewicht des Pellets abzugleichen. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 10 Milliliter NP-40-Puffer mit einem Proteaseinhibitorcocktail im Verhältnis 1:2000. Mischen Sie die beiden Zellkulturen, indem Sie direkt ein Reagenzglas in das andere umgießen.

Um mit dem Zerkleinern der Zellen zu beginnen, gießen Sie zunächst flüssigen Stickstoff in die vorgekühlte MörserSchale und lassen Sie ihn vollständig verdampfen. Fügen Sie danach zwei Milliliter Zellen zum Mörser hinzu. Gießen Sie etwas flüssigen Stickstoff hinzu, um die Zellen einzufrieren.

Zerkleinern Sie die Zellen, bis sie zu einem feinen Pulver werden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen zerkleinert sind. Achten Sie darauf, dass die Zellen nicht auftauen.

Fügen Sie bei Bedarf flüssigen Stickstoff hinzu. Danach überführen Sie das Pulver in einen eiskalten Becher und lassen es bei Raumtemperatur auftauen. Wenn die Ränder beginnen aufzutauen, geben Sie 20 Milliliter NP-40-Puffer mit einem 1:200 PIC zu, nachdem es aufgetaut ist.

Überführen Sie das rohe Lysat in 40-Milliliter-Nalgene-Röhrchen und zentrifugieren Sie 30 Minuten bei 16.000 U/min im Sovos-SA-600-Rotor. Währenddessen entnehmen Sie 300 Mikroliter der SROs two B-Kügelchen und waschen die Kügelchen dreimal mit jeweils 300 Mikrolitern NP-40-Puffer. Anschließend resuspendieren Sie die Kügelchen in 300 Mikrolitern Puffer, sodass eine Slurry im Verhältnis eins zu eins vorliegt.

Der nächste Schritt besteht darin, das Zelllysat vorzubereinigen. Überführen Sie hierzu zunächst das Supernatant in ein neues Gefäß und geben Sie die Spheros Two B-Kügelchen hinzu. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang auf einer rotierenden Plattform im Kühlschrank.

Während der Inkubation entnehmen Sie 300 Mikroliter IgG-SROs mit sechs Perlen und waschen die Perlen dreimal mit jeweils 300 Mikrolitern NP-40-Puffer. Anschließend resuspendieren Sie die Perlen in 300 Mikrolitern Puffer, sodass eine Suspension im Verhältnis eins zu eins vorliegt. Nach der Inkubation pelletieren Sie die SROs.

Zwei Perlen darin. Überführen Sie den Überstand in ein neues Gefäß. Denken Sie daran, eine Aliquotprobe des Zelllysats für eine spätere Westernblot-Analyse aufzubewahren.

Dann die IgG-Perlen hinzufügen. Den Inhalt auf zwei Röhrchen aufteilen, um eine effizientere Bindung zu ermöglichen, und zwei Stunden lang auf einer rotierenden Plattform im Kühlschrank inkubieren. Nach der Inkubation die Perlen in einer Chromatographiesäule bei vier Grad Celsius sammeln.

Stellen Sie sicher, dass Sie eine Aliquot aus der ungebundenen Fraktion aufbewahren. Waschen Sie die Kügelchen mit 10 Milliliter NP-40-Puffer.

Anschließend waschen Sie die Kügelchen mit drei Millilitern TEVC-Puffer. Denken Sie auch hier daran, eine Aliquotprobe der Kügelchen aufzubewahren.

Dies spiegelt die Effizienz der Bindung wider, um die Perlen zu eluieren. Geben Sie zunächst fünf Mikroliter A-C-T-E-V zu einem Milliliter TEVC-Puffer. Geben Sie TEVC-Puffer zu den Perlen hinzu und mischen Sie gut.

Überführen Sie den Inhalt in zwei 1,5-Milliliter-EINOR-Röhrchen, um eine effizientere Vermischung zu erzielen, und inkubieren Sie über Nacht auf einer rotierenden Plattform im Kühlschrank. Anschließend zentrifugieren Sie die Kügelchen und überführen das Eluat in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Kügelchen nach dem Waschen mit zusätzlichen 0,5 Millilitern TEVC-Puffer.

Vereinigen Sie die acht in einem Gefäß. Insgesamt sollten Sie 1,5 Milliliter ELU acht erhalten. Heben Sie ein Aliquot des TEV-Elu acht zum Präzipitieren auf.

Pipettieren Sie Aliquote auf 25 % TCA mit 100 % TCA ein. Teilen Sie dazu 1,5 Milliliter LU acht in zwei Röhrchen zu je 750 Mikrolitern auf. Geben Sie 250 Mikroliter 100 % TCA zu dem Röhrchen hinzu.

Ihre Lösung sollte trüb werden. Stellen Sie sie anschließend 30 Minuten lang auf Eis. Wirbeln Sie die Mischung periodisch nach der Inkubation.

Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge im Kühlschrank. Waschen Sie einmal mit 500 Mikrolitern eiskalter Acetonlösung, die 0,05 Normal Salzsäure enthält. Anschließend zentrifugieren Sie fünf Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius.

Anschließend einmal mit 500 µL eiskaltem Aceton waschen und fünf Minuten bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Aceton vorsichtig entfernen und das Pellet zum Silberfärbemustertrocknen. Das Pellet in 50 µL einesfachen SDS-Probenpuffer resuspendieren.

Wenn Sie das präzipitierte Protein für eine massenspektrometrische Analyse verwenden möchten, wird empfohlen, Ethanol zur Präzipitation zu verwenden. Geben Sie hierzu zunächst 20 Mikrogramm Glykogen hinzu, verdünnen Sie die Proben anschließend fünfmal mit hundertprozentigem Ethanol und stellen Sie mit einem 2,5-molaren Stammlösung auf 50 Millimolar Natriumbicarbonat bei pH 5,0 ein. Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Gefäß umdrehen.

Lassen Sie es zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen. Teilen Sie den Inhalt schließlich auf zwei Eppendorfgefäße auf. Pelletieren Sie das ausgefällte Protein durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 12.000 ×g bei Raumtemperatur.

Die während des Reinigungsverfahrens entnommene Aliquot sollte das vorgeklärte Zelllysat, die gebundene Fraktion, die ungebundene Fraktion und die eluierte Fraktion umfassen. Wir empfehlen, den Proteingehalt der oben genannten Aliquote mittels Western Blot unter Verwendung eines Anti-TAP-Antikörpers oder durch Silberfärbung zu analysieren, um die Bindungs- und Elutions-Effizienz des Experiments darzustellen. In diesem Silberfärbegel wurde gereinigtes SCS-TAP zusammen mit seinen Interaktionspartnern sichtbar gemacht und mit einer nicht markierten Kontrolle in diesem Western Blot verglichen.

Verschiedene Fraktionen, die während der Reinigung von SCS two tap gewonnen wurden, wurden mittels Western Blotting mit Antit tap-Antikörper analysiert. Beachten Sie, dass SCS two tap nach der Elution durch TEV-Protease-Spaltung bei einem niedrigeren Molekulargewicht wanderte und kein SCS two tap mehr auf den IgG-Kügelchen nach der Elution verblieb. Dies bestätigte, dass die Reinigung äußerst effizient war.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Protein-Komplexe mittels Affinitätsreinigung mit IgG-Kügelchen aufreinigt. Bei dieser Methode ist es wichtig, darauf zu achten, den Basistamm und den Kontrollstamm vor Beginn der Reinigung nach Trockenpellet-Gewicht anzupassen. Da LAC uns unverzerrte und gekoppelte Messungen von Protein-Bindungspartnern liefert, führen wir nur die erste Stufe der TAP-Reinigung durch, um Probenvolumenverluste zu minimieren.

Wenn Sie eine erhebliche unspezifische Bindung beobachten, empfiehlt es sich, das gesamte Protokoll durchzuführen, das im Cold Springing Harbor Manual beschrieben ist. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Komm schon, Mark. Ah, los geht's.