Identifizierung von Protein-Komplexen in

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, Proteine, Proteinwechselwirkungen und die Untereinheitenzusammensetzung nativer MultiPro-Komplexe aus E. coli zu identifizieren. Dazu werden sequenzspezifische lineare PCR-Produkte amplifiziert, die den SPA-Tag und einen selektierbaren Marker kodieren und in einem ddy 3, 3 0 Hintergrund als carboxyterminale Fusionen mithilfe des bakteriellen Fage-Lambda-Rekombinationssystems integriert und exprimiert werden. Anschließend erfolgt eine zweistufige Reinigung unter Verwendung von Cow-Modlin- und Anti-Flag-Affinitätskügelchen, um proteinreiche Komplexe mit geringer Häufigkeit effizient anzureichern. Danach werden die gebundenen Proteine, die mit Cow-Modlin-Puffer oder CEB eluiert wurden, mit Trypsin verdaut und mittels Massenspektrometrie zur Proteinidentifizierung analysiert.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass mehrere Untereinheiten des kernartigen RNA-Polymerase-Enzyms, einschließlich der Transkriptionsbeendigungs- und Anti-Determinationsfaktoren, effizient mit dem markierten RNA-Polymerase-Untereinheiten-D-Protein mitgereinigt wurden, was darauf hindeutet, dass neu assoziierte Komponenten mithilfe dieses Ansatzes effizient identifiziert werden können. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, Schwierigkeiten mit zweistufigen Affinitätsreinigungen, bei denen eine sorgfältige Aufarbeitung der Zelllysate mit geeigneten Pufferlösungen unbedingt erforderlich ist, um eine erfolgreiche und effiziente Gewinnung von Komplexen mit geringer und hoher Häufigkeit aus großskaligen Kulturen sicherzustellen. Die Affinitätsreinigung und die Massenspektrometrie-Verfahren werden von Olga Kagan und HBO guo, zwei Technikerinnen in meinem Labor, demonstriert. Dieses Protokoll beginnt mit der gezielten Amplifikation spezifischer Sequenzen für den DDY drei 30-Stamm, in dem die Lambda-red-Rekombinationsmaschinerie wie im schriftlichen Protokoll beschrieben exprimiert wird.

Anschließend die Bakterienstämme mit exprimierendem Lambda-Rekombinationssystem über Nacht in zwei Millilitern Luria-Bouillon oder LB-Medium bei 32 Grad Celsius kultivieren, dabei am folgenden Tag mit 180 U/min schütteln. Inokulieren Sie einen Milliliter der Übernachtkultur in 70 Milliliter frisches LB-Medium in einem 500-Milliliter-Konikalfläschchen. Kultivieren Sie den Inokulum bei 32 Grad Celsius unter Schütteln mit 180 U/min, bis die OD 600 etwa 0,8 erreicht. Induzieren Sie die Zellen, indem Sie das Fläschchen 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius unter vorsichtigem Schütteln mit 180 U/min inkubieren.

Unmittelbar nach der Induktion inkubieren Sie das Kolben in einem Eiswasserbad für mindestens 30 Minuten unter Schütteln. Nachdem die Zellen wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben geerntet und gewaschen wurden, suspendieren Sie das Zellpellet in 700 Mikrolitern eiskaltem, sterilem Wasser, wodurch elektrokompetente Zellen für die Elektroporation entstehen. Geben Sie ein Mikroliter des gereinigten Amplikons in 40 Mikroliter der elektrokompenten Zellen.

Die Zellen werden nach der homologen Rekombination und Integration elektroporiert. Die Transformanten, die den Tag-Spalte-Kassette erfolgreich in das Chromosom rekombiniert haben, werden anhand ihrer Resistenz gegen Canamycin ausgewählt. Wählen Sie mehrere Transformanten für die Westernblot-Analyse aus, um die korrekte Generierung der SPA-markierten Fusionsproteine mit dem Anti-Flag-M2-Antikörper zu verifizieren, der spezifisch gegen die Flag-Epitope des SPA-Tags gerichtet ist. Überführen Sie 10 Milliliter der Übernachtkultur in 990 Milliliter frisches TB, das mit 25 Mikrogramm pro Milliliter Canamycin in einem 4-Liter-Kolben ergänzt wurde.

Züchten Sie die Kultur bei 32 Grad Celsius mit ständigem Schütteln bei 250 U/min für fünf bis sechs Stunden, bis die OD 600 zwischen zwei und drei liegt. Überführen Sie die ein Liter E. coli SPA-Tag-Kultur in saubere Zentrifugierflaschen und zentrifugieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius und 3.993 ×g für 15 Minuten. Nach dem erneuten Aufschwemmen der Zellen gemäß der schriftlichen Anleitung.

Überführen Sie die Proben in einen sterilen Edelstahlbehälter, der auf Eis liegt, um sie zu sonifizieren. Tauchen Sie die Sonde in die Probe ein und führen Sie die Sonifikation drei Minuten lang durch. Nach der Sonifikation lassen Sie die Probe weitere zwei Minuten abkühlen, um eine Überhitzung nach der Zentrifugation des sonifizierten Lysats zu vermeiden.

Übertragen Sie das S-Supernatant vorsichtig von dem Zentrifugenröhrchen in ein 50-Milliliter-Polypropylen-Falcon-Röhrchen. Gefrieren Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie den sonifizierten, gefrorenen Zellextrakt bis zu sechs Monate lang bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Anwendungen. Um die Affinitätsreinigung des gefrorenen, sonifizierten Zellextrakts zu beginnen, stellen Sie das Röhrchen in kaltes Wasser und inkubieren Sie den TH-Zellextrakt mit drei Mikrolitern Benzo, einer Nuklease, 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Zu dieser Mischung werden nichtionischer Detergens Triton X-100 und 200 µL Suspensionen von Anti-Flag M2-Agro-Beads hinzugefügt. Der Inhalt wird vorsichtig durch Drehen des Reaktionsgefäßes drei Stunden lang bei vier Grad Celsius vermischt. Nach dreistündiger Rotation wird das Reaktionsgefäß bei 1.700 ×g sechs Minuten lang zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird vorsichtig so viel wie möglich der Überstand entfernt, wobei das lockere Pellet nicht gestört werden darf.

Suspendieren Sie das Pellet erneut im verbleibenden SNA und überführen Sie es dann in eine Polypropylen-Vorbereitungssäule. Entfernen Sie die unteren Verschlüsse der Säule, um das Eluat durch Schwerkraft abfließen zu lassen. Waschen Sie anschließend die Säule fünfmal mit jeweils 200 Mikrolitern eines einmaligen FC-Puffers und fahren Sie mit der Spaltung durch TEV wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben fort.

Nach der Spaltung schnell sowohl oben als auch unten an der Säule fest. Vorsichtig den Inhalt in der Säule durch Drehen über Nacht bei vier Grad Celsius nach der Übernachtdrehung mischen. Das Eluat ablaufen lassen, indem man die obere Kappe und den unteren Stopfen entfernt und in die neue Säule leitet.

Spülen Sie die alte Säule mit 400 Mikrolitern eines 1 x Cal-Modlin-Bindungspuffers und einer 150-Mikroliter-Suspension von Cal-Modlin-Bindungskügelchen. Eluieren Sie das gebundene Protein in vier Fraktionen zu je 50 Mikrolitern in einem frischen Eppendorf-Röhrchen unter Verwendung eines 1 x Cal-Modlin-Elutionspuffers.

Verteilen Sie die eluierte Fraktion gleichmäßig auf zwei saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Anschließend wird der Inhalt beider Röhrchen im Speed-Vac getrocknet. Das getrocknete Eluat aus einem Röhrchen wird für die Durchführung eines Silberfärbegels gemäß der Beschreibung im Text verwendet, während das andere bei minus 80 Grad Celsius gelagert wird.

Fügen Sie für die spätere Verwendung in der Massenspektrometrie 50 µL Puffer für die Verdauung und 0,9 µL 100 mmolar Tris-Phosphin-Hydrochlorid zu der getrockneten Probe hinzu und inkubieren Sie die Mischung 45 Minuten bei Raumtemperatur für den Reduktionsschritt. Fügen Sie anschließend 1 µL 500 mmolar Iodoacetamid hinzu und inkubieren Sie die Probe weitere 40 Minuten im Dunkeln, um die Alkylierung der Probe zu ermöglichen. Nach der zweiten Inkubationsrunde geben Sie 1 µg Trypsin zur Mischung hinzu. Inkubieren Sie die Probe entweder fünf Stunden bei 37 °C oder über Nacht bei Raumtemperatur, gefolgt von der Inkubation.

Stellen Sie sicher, dass die Reaktion durch Zugabe von einem Mikroliter Essigsäure angehalten wird. Bereiten Sie dann die Millipore-Zip-Spitze, die Pipettenspitze gemäß der im Text beschriebenen Anleitung vor, um eine effiziente Bindung des Peptids an die Spitze zu gewährleisten. Mischen Sie das Peptidgemisch 20-mal, um das Peptidgemisch, das an der Spitze haftet, durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren der Waschlösung abzuwaschen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um eine effiziente Bindung der Peptidmischung an die Spitze mit dem gebundenen Peptid zu gewährleisten. Aspirieren Sie 10 Mikroliter der Benetzungs- und Äquilibrierungslösung und geben Sie sie in ein sauberes Sammelröhrchen ab. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.

Nach dem Eindampfen der eluierten Proben in einer Schnellvakuumanlage können die Proben entweder unmittelbar mittels Massenspektrometrie analysiert oder vor der Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Die in diesem Verfahren verwendeten Mikrosäulen sind mit etwa 10 Zentimetern dreimikronigem lunar C18-Harz gepackt und mit einer Pro-Zion-Nano-Elektrospray-Ionisationsquelle gekoppelt, die inline mit dem Orbitrap-Gerät angeordnet ist. Eine Pro-Zion-Nano-Fluss-binäre HPLC-Pumpe wird verwendet, um während der Peptidtrennung eine stabile Spitzenflussrate von etwa 300 Nanolitern pro Minute bereitzustellen, um eine Peptidverdünnung zu erreichen, und einen organischen Puffergradienten entsprechend der Komplexität der Probe einzurichten.

Für diese E. coli-SPA-Probe enthält die mobile Phase Lösungsmittel A 95 % HPLC-Gradientenwasser und 5 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure, während Lösungsmittel B 5 % HPLC-Gradientenwasser und 95 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure enthält. Nach der Massenspektrometrie erfolgt die Suche der Spektren mithilfe eines Datenbanksuchalgorithmus wie SEQUEST gegen eine Datenbank von E. coli-Proteinsequenzen. Die Ergebnisse werden statistisch mithilfe eines Wahrscheinlichkeitsalgorithmus wie STAR-QUEST gefiltert, um eine geringe falsche Entdeckungsrate sicherzustellen. Sowohl der mit SPA markierte RNA-Polymerase-Sigmafaktor als auch das YakL-Protein unbekannter Funktion wurden spezifisch zusammen mit dem kerngebundenen RNA-Polymerase-Enzym, einschließlich der alpha-, beta- und beta’-Untereinheiten sowie des RNA-Polymerase-Recycling-Faktors, mitgereinigt. Im Gegensatz zum markierten RNA-Polymerase-Sigmafaktor band das YakL zudem an einen essentiellen Faktor für die Transkriptions-Terminierung und Anti-Determinierung, was auf eine spezialisierte Funktion in der Transkription hindeutet.

Mehrere andere kleinere mitreinigende Proteine wurden ebenfalls mittels LC-MS nachgewiesen, die im Gel nicht sichtbar waren, darunter die Omega-Untereinheit der RNA-Polymerase sowie Faktoren der Transkription, Terminierung und Differenzierung sowie USA und NUSD. Umgekehrt ergab ein unabhängiges Experiment zur markierten Mobilisierung der Schwefel-Apparatur, dass S-U-F-B-S-U-F-C und SUFD jeweils miteinander mitreinigten, was auf eine gemeinsame Beteiligung an der Eisen-Schwefel-Cluster-Biosynthese als einzelner Gerüstkomplex hinweist. Dieses repräsentative Beispiel verdeutlicht, dass bereits gut untersuchte, hoch annotierte bakterielle MultiPro-Komplexe, die an essentiellen biologischen Prozessen beteiligt sind, häufig neuartige assoziierte Komponenten besitzen, die effizient identifiziert werden können.

Mithilfe dieses Ansatzes könnte die geringe Kopienzahl des SUFB-Proteins zu einer schwachen Signalintensität im Vergleich zur starken Intensität geführt haben, die bei den Pull-down-Experimenten mit SUFC und SUFD beobachtet wurde, um die Zusammensetzung stabiler mehrteiliger Protein-Komplexe zu bestimmen. Für hochgradig verlässliche Wechselwirkungen wurden Co-Purifikationswerte vergeben, wobei die Einzigartigkeit der Beziehungen zwischen Köder und Beute, Köder und Köder sowie Beute und Beute berücksichtigt wurde. Anschließend wurden mithilfe von Graph-Clustering-Verfahren wie dem Markoff-Clustering-Algorithmus diskrete Protein-Cluster aus dem partitionierten probabilistischen PPI-Netzwerk identifiziert.

Putative Interaktionsnetzwerke können mithilfe von Cytoscape visualisiert werden. Die Kombination von Proteomik-Daten mit zusätzlichen funktionellen Assoziationsnachweisen, die durch genomische Methoden erschlossen werden, kann verwendet werden, um neuartige mechanistische Funktionen bereits annotierter E. coli-Proteine zu untersuchen. Hier wurden Subnetze von Protein-Komplexen und funktionellen Modulen definiert, die als umfassendere funktionelle Nachbarschaften in E. coli auftreten.

Der Haupt-Hierarchische Cluster von Graham zeigt die Muster funktioneller Vorhersagen und bestehender Annotationen für die funktionell verwaisten und charakterisierten Gene von E. coli; gelbe und blaue Farben repräsentieren jeweils bestehende und abgeleitete Funktionen, während die Intensität der Schattierung die Konfidenzwerte widerspiegelt. Auf der rechten Seite sind die biologischen Prozesse angegeben, die mit verschiedenen Nachbarschaften assoziiert sind; Einzelansichten zeigen die individuellen Komponenten einer repräsentativen Nachbarschaft basierend auf den Ähnlichkeitsscores des integrierten physikalischen und funktionalen Interaktionsnetzwerks. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie stabile Protein-Komplexe aus E. coli mittels Affinitätsreinigung gekoppelt mit Massenspektrometrie isoliert werden können.

Im Prinzip kann diese Technik zur Charakterisierung von Membranproteinkomplexen oder Proteinkomplexen aus beliebigen anderen Arten angewendet werden, sofern eine Rekombination möglich ist.