Focal Ca ^{2 +} Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Zunächst wird eine Kalzium-Ladelösung hergestellt, erwärmt und durchgebläst. Die Harnblase wird präpariert, geöffnet, flach ausgebreitet und fixiert, und ein Streifen Detrusormuskel wird entnommen. Der Detrusorstreifen wird der Ladelösung zugegeben, inkubiert und gespült, dann flach ausgebreitet und fixiert.

Der Kalziumspiegel vier im Gewebe wird durch Laserlicht angeregt und das resultierende emittierte Licht wird erfasst. Filme, die aus einzelnen Bildern bestehen, werden analysiert, indem aufeinanderfolgende Bilder verglichen werden. Der Hintergrund wird subtrahiert.

Die Schwellenbestimmung für die Zellgrenze legt fest, an welchen Stellen Ereignisse gefunden werden können, und es wird ein Verhältnis zwischen aufeinanderfolgenden Gehirnen gebildet. Wenn die verbleibenden Ereignisse vordefinierten Kriterien entsprechen, werden sie hervorgehoben und beschriftet. Hallo, mein Name ist John Young aus den Laboren von Keith Brain und Tom Kinane am Department für Pharmakologie der Universität Oxford.

Ich bin Rob Amos, ebenfalls aus den Laboren von Brain und Canne, und mein Name ist Keith Brain. Heute werden Ihnen John und Rob eine Kalzium-Bildgebungstechnik in glattem Muskelgewebe vorführen. Wir verwenden diese Technik in unserem Labor, um die Freisetzung von Neurotransmittern aus autonomen Nerven und deren Wirkung auf glatte Muskulatur zu untersuchen.

Beginnen wir. Der Kalziumindikator Organ Green, 4 88 BAFTA 1:00 AM liegt in 500-Mikroliter-Fläschchen vor, die 50 Mikrogramm Pulver enthalten. Um den Kalziumindikator vorzubereiten, geben Sie 40 Mikroliter Onic-F1-27-Lösung zum Pulver hinzu und schütteln vorsichtig für 30 Sekunden. Danach geben Sie 460 Mikroliter physiologischer Salzlösung (PSS) hinzu und schütteln erneut vorsichtig für 30 Sekunden.

Die endgültige Lösung, 10 Mikromolar Organ Green. 4 88 BAFTA 1:00 AM liefert vier Aliquots zu je 125 Mikroliter. Vermeiden Sie Lichteinwirkung und lagern Sie die Lösung vor der Dissektion des interessierenden Gewebes bei minus 20 Grad Celsius.

Entfernen Sie den Kalziumindikator aus dem Gefrierschrank und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur auftauen, während der Kalziumindikator dünn ist. Geben Sie ein Milliliter PSS in ein Reagenzglas und stellen Sie es in ein Wasserbad bei 33 Grad Celsius. Befestigen Sie einen Belüfter mit einem Stopfen im Reagenzglas, oder Sie können auch Perfil verwenden und dann mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid mit einer Rate von etwa einer Blase pro Sekunde durchblubbern.

Isolieren Sie das glatte Muskelorgan vom Tier. In diesem Fall handelt es sich um die Harnblase einer Maus. Legen Sie das Organ in etwa 50 Millimeter PSS, um es zu waschen; nachdem das Gewebe sorgfältig gewaschen wurde, entfernen Sie das perivesikale Fettgewebe und das Bindegewebe.

Präparieren Sie die Harnblase nach dem Typ des glatten Muskelgewebes von Laurean. Öffnen Sie die Harnblase längs vom Blasenhals, vom kaudalen bis zum oberen Ende des Blasendoms. Präparieren Sie am kranialen Ende vier Streifen, sechs bis acht Millimeter lang und ein bis zwei Millimeter breit, entlang der dorsalen Oberfläche des Resser in Richtung der dominierenden Muskelbündel.

Geben Sie das dissezierte Gewebe und das vorgewärmte und durchperlte PSS in ein Reagenzglas, um den Calciumindikator zuzusetzen: 125 Mikroliter 10-Mikromolar-Organ-Green-488B um 01:00 Uhr zum Gewebe geben und das Reagenzglas leicht von Hand schütteln, um es zu mischen. Stellen Sie das Reagenzglas zurück in das Wasserbad. Setzen Sie das Durchperlen fort und decken Sie das Wasserbad mit einem Blatt Aluminiumfolie ab.

Die Zeit, die benötigt wird, bis ausreichend Gewebe den Kalziumindikator aufgenommen hat, variiert je nach Größe des Gewebes und Dicke der glatten Muskulatur. Beispielsweise beträgt die Inkubationszeit für den Detrusor der Maus und die Ratten-Oxs 70 Minuten. Dagegen inkubieren wir den Detrusor der Ratte und die Maus-VAs deens 120 Minuten lang.

Nachdem das Gewebe mit dem Kalziumindikator beladen wurde, kann es für die Mikroskopie vorbereitet werden. Spülen Sie das Gewebe zunächst 10 Minuten lang mit belüfteter PSS. Bringen Sie danach das Gewebe in einer mit einem S-Schild ausgekleideten Probenschale unter.

Leicht dehnen, um ein flaches Blatt zu bilden. Befestigen Sie das Gewebe mit kurzen Stücken, zum Beispiel zwei Millimeter langen Silberdrähten mit einem Durchmesser von 25 bis 50 Mikrometer, und stecken Sie die Drähte in einem Winkel ein.

Verwenden Sie keine Nadeln, die länger als einige Millimeter sind, da sie das Objektiv zerkratzen könnten. Eine sorgfältige Befestigung des Gewebes mit Nadeln ist wichtig, um spontane Bewegungen des Gewebes zu minimieren und die Lokalisation einer geeigneten Stelle für die Bildaufnahme zu erleichtern. Nachdem das Gewebe befestigt wurde, stellen Sie die Präparationschale auf den Mikroskoptisch.

Stellen Sie sicher, dass das PSS nicht aus dem mit Silikongummi abgedichteten Bereich der Schale entweicht, da dies dazu führen kann, dass ein großer Bereich mit PSS bedeckt wird. Wenn die Überströmung zu Demonstrationszwecken beginnt, werden die folgenden Schritte im Licht durchgeführt.

Bitte beachten Sie, dass diese Experimente normalerweise im Dunkeln durchgeführt werden. Schalten Sie die Pumpe ein, um die Präparation zu überströmen. Mit PSS wird häufig eine Rate von 100 Milliliter pro Stunde verwendet.

Schalten Sie die Heizeinheit ein, platzieren Sie die Zu- und Ablaufschläuche sowie die Temperatursonde auf der Präparationswanne, indem Sie diese mit dem Magneten an der Basis an dem Metallstreifen befestigen. Die Höhe der Spitze des Ablaufschlauchs bestimmt die Tiefe der PSS. Achten Sie sorgfältig darauf, dass die Ablaufleitung die PSS tatsächlich abführt, da dies manchmal nicht der Fall ist.

Stellen Sie zunächst die Temperatur der Heizeinheit so ein, dass die gewünschte Temperatur zwischen 33 und 35 Grad Celsius erreicht wird. Lassen Sie das Gewebe mindestens 10 Minuten mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung equilibrieren. 10 oder 20 Mal.

Verwenden Sie Epifluoreszenz oder Anregung mit blauem Licht, um die glatte Muskulatur zu betrachten und eine geeignete Region zur Überwachung zu identifizieren. Da die Belichtung mit Anregungslicht den Indikator ausbleichen wird, vermeiden Sie die Anwendung für mehr als nur wenige Sekunden auf einmal.

Vermeiden Sie Aufnahmen mit hellen Strukturen, da diese eine hohe Anzahl falsch-positiver Ergebnisse im Bilderkennungsalgorithmus verursachen können. Wählen Sie einen Bereich mit minimaler Bewegung und einer großen Anzahl glatter Muskelzellen im Sichtfeld. Sobald Sie die Aufnahmestelle ausgewählt haben, wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung, beispielsweise 40 x.

Drehen Sie den Objekttisch oder die optische Achse so, dass die glatte Muskelzelle oder die glatten Muskelzellen horizontal liegen, also parallel zur schnellen Scan-Achse. Die glatten Muskelzellen sind nun bereit für die Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie.

In diesem Protokoll verwenden wir ein aufrechtes konfokales Mikroskop vom Typ Leica SP zwei. Schließen Sie die Blende auf eine Airy-Scheibe. Stellen Sie die Laserleistung zwischen 25 und 35 % am kundenspezifischen optischen abstimmbaren Filter ein.

Dieser Wert stellt einen Kompromiss zwischen Helligkeit und photobleaching dar. Um die Datenauswertung vorzubereiten, laden Sie ImageJ herunter und installieren Sie es. Laden Sie die plattformspezifische Version herunter und aktualisieren Sie anschließend auf die neueste Version, indem Sie die aktuelle ImageJ-JAR-Datei herunterladen, um die alte Datei zu ersetzen. Danach laden Sie die Excel-Writer-JAR-Datei herunter und installieren sie in das Plugins-JAR-Verzeichnis.

Kopieren Sie diese Dateien in das Plugins-Verzeichnis. Installieren Sie jedes dieser Skripte mithilfe der Plugins-Makros. Installationsfunktion von Image J. Die Software für das von uns verwendete Leica SP2-Konfokalmikroskop, die Leica heißt.

LCS speichert einzelne Einzelbilder jeder Serie als separate Datei. Um die Serie zu rekonstruieren, stellen Sie sicher, dass alle zu rekonstruierenden Einzelbilder in einem einzigen Ordner enthalten sind.

Beispielweise der Datenordner mit TIFFs. Anschließend wählen Sie das Leica SP two Stacker-Makro aus dem Menü Plugins – Makros aus. Wählen Sie das Stammverzeichnis, in diesem Fall den Datenordner.

Wählen Sie den gewünschten Ordner aus der Dropdown-Liste aus. Wählen Sie in diesem Fall tiffs ein Ausgabeverzeichnis aus oder erzeugen Sie ein neues. Zum Beispiel Datenordner stacks.

Das Skript rekonstruiert anschließend die Serie aus einzelnen Bildern, um Bewegungen zu korrigieren. Wir verwenden einen frei verfügbaren Algorithmus, der Bilder innerhalb eines Serien-Download-Stacks ausrichtet oder zusammenpasst: rig und turbo reg. Kopieren Sie die Dateien für jeden Algorithmus in den Stacks-Ordner.

Laden Sie einen Stapel zur Verarbeitung und wechseln Sie dann zu einem Frame, der das interessierende Feld deutlich zeigt. Alle anderen Frames werden an diesem Referenzframe ausgerichtet. Danach wechseln Sie zu Plugins-Stapeln.

Stapel-Reg. Testen Sie jede der verschiedenen Transformationen, um festzustellen, welche für jede Stelle am effektivsten ist. Abgebildete Faktoren, die die Detektion von Kalziumtransienten beeinflussen, variieren je nach Messung bestimmter Eigenschaften und Partikelparameter jeder Stelle.

Die Empfindlichkeit und Spezifität der Detektion werden erhöht. Für jede Stelle berechnen wir daher den Schwellenwert für das subtrahierte Verhältnis und den Zellkantenschwellenwert. Gehen Sie zunächst zu Plugins, Makros, Installieren und wählen Sie jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Danach gehen Sie zu Plugins, Makros, Stapel laden.

Wählen Sie eine Serie aus und berechnen Sie die folgenden Partikelparameter. Um die Schwelle für subtrahiert zu berechnen, wählen Sie einen rechteckigen interessierenden Bereich über dem aus, was Sie als Hintergrundmessung ansehen. Notieren Sie den Mittelwert. Um die Schwelle für das Verhältnis zu berechnen, wählen Sie einen rechteckigen interessierenden Bereich um einen optisch flachen Bereich der glatten Muskelzelle oder der glatten Muskelzellen herum aus.

Messen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung und notieren Sie diese. Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal, oder zeichnen Sie drei Boxen gleichzeitig, indem Sie die Umschalttaste drücken. Berechnen Sie das Schwellenwertverhältnis und notieren Sie es.

Berechnen Sie die Standardabweichung geteilt durch den Mittelwert, addieren Sie eins und multiplizieren Sie das Ergebnis anschließend mit 32. Bei Mittelung der Werte aus den drei Wiederholungen ist der Faktor 32 notwendig, um den Verhältnisalgorithmus zu berücksichtigen, bei dem keine Änderung gegenüber dem vorhergehenden Bild auf einen ganzzahligen Wert von 32 abgebildet wird. Dies ermöglicht einen guten dynamischen Bereich, um Zunahmen und Abnahmen des Verhältnisses zu detektieren.

Wählen Sie bei einem 8-Bit-Bild Bild Anpassen Schwellenwert. Wählen Sie Schwarz und Weiß. Definieren Sie unterhalb der oberen Schiebegrenze und notieren Sie den entsprechenden Wert.

Dies befindet sich rechts vom Schieberegler. Nur Ereignisse in den schwarzen Bereichen werden gezählt. Klicken Sie auf „Zurücksetzen“.

Nachdem nun die Schwellenwerte für die subtrahierte Ratio und die Zellkantenschwelle berechnet wurden, können wir die Bildstapel analysieren. Bestimmen Sie den Speicherort der zu analysierenden Stapel. Wählen Sie an diesem Punkt nur eine Serie aus.

Das ist die erste Datei, und die letzte Datei sollte identisch sein. Wählen Sie anschließend einen Speicherort für die Ausgabe der Datendateien und -stapel aus. Zum Beispiel: Ausgabeordner für Daten.

Geben Sie Schwellenwerte für die Subtraktion der Schwelle für das Verhältnis und der Kantenschwelle ein. Belassen Sie die übrigen Einstellungen bei ihren Standardwerten. Der Algorithmus erzeugt ein Fenster mit zwei Bereichen, in dem die verarbeitete Serie links und die ursprüngliche Serie rechts angezeigt wird.

Öffnen Sie diese Datei aus dem Ausgabeordner und prüfen Sie sorgfältig die Anzahl der falsch-positiven Ergebnisse sowie die Fälle, in denen mit bloßem Auge sichtbare Ereignisse nicht erkannt wurden. Für jede Serie erstellt der Algorithmus eine Excel-Datei, die Merkmale der erkannten Ereignisse wie Amplitudenbereich und Position beschreibt. Falsch-positive Ergebnisse, die durch Überprüfung der vom Algorithmus erzeugten Bilddateien identifiziert wurden, können manuell aus dieser Excel-Datei entfernt werden, obwohl hierfür strenge Kriterien gelten sollten.

Dies ist ein Film der Kalzium-Transienz in glattem Muskelgewebe. In diesem Beispiel besteht der Film aus 100 einzelnen Einzelbildern, die mit fünf Hertz aufgenommen wurden. Im Rahmen einer Untersuchung, beispielsweise des Einflusses eines bestimmten Medikaments auf die Frequenz der Kalzium-Transienzen, würden wir pro Experiment viele solcher Filme aufnehmen.

Hier sehen wir zahlreiche spontane Kalzium-Transientes in den glatten Muskelzellen. Das Ergebnis des Partikelerkennungsalgorithmus ist hier dargestellt. Für jede Serie erstellt der Algorithmus eine Excel-Datei, die Merkmale des erkannten Ereignisses wie Amplitude, Fläche und Position beschreibt.

Wir haben also eine Methode zur Abbildung von Kalziumtranchen in glatten Muskeln von Organen wie der Harnblase demonstriert und gezeigt, wie wir diese Kalziumtransienten mithilfe eines im Labor entwickelten Algorithmus analysieren. Wichtig ist, das Gewebe sorgfältig auf die Kalzium-Bildgebung vorzubereiten. Im Fall des heute dargestellten Gewebes bedeutet dies, Bindegewebe und jegliches Fettgewebe zu entfernen, das das Sichtfeld behindern könnte.

Es ist außerdem wichtig, das Gewebe als flache Schicht zu fixieren. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten und danke fürs Zuschauen.