Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur
2. Juni 2023
Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie ist eine Methode zur Untersuchung von Proteindomänenbewegungen in Echtzeit. Die Modifikation dieser Technik für ihre Anwendung in nativen Zellen ermöglicht nun die Detektion und Verfolgung einzelner Spannungssensorbewegungen von spannungsabhängigen Ca2+ -Kanälen in murinen isolierten Skelettmuskelfasern.
CaV1.1, ein Mitglied der spannungsabhängigen Ionenkanäle, verfügt über vier verschiedene Spannungssensoren. Es gibt Hinweise darauf, dass einige Spannungssensoren mehr zur Aktivierung des Ryanodinrezeptors oder des Kalziumstroms beitragen. Unser Ziel ist es, die genaue Rolle jedes Spannungssensors bei der Anregungs-Kontraktions-Kopplung und der Aktivierung des Kalziumkanals zu identifizieren.
Die Anregungs-Kontraktions-Kopplung wird seit den frühen 50er Jahren untersucht, doch die molekularen Details, wie dieser Prozess abläuft, sind noch unbekannt. Jüngste Fortschritte in der zyroelektronenmikroskopischen Struktur des Kanals, die Charakterisierung eines neuartigen CaV1.1-akzessorischen Proteins, die Entdeckung einer alternativen Spleißvariante des Kanals und die Identifizierung von krankheitsverursachenden Mutationen haben das Interesse an diesem Gebiet neu entfacht. In unserem Fachgebiet werden viele Techniken eingesetzt, von der klassischen Elektrophysiologie und Molekularbiologie bis hin zu neuartigeren Techniken wie Kryo-Elektronenmikroskopie, molekulardynamischer Simulation, gezieltem Proteinabbau und funktioneller ortsgerichteter Fluorometrie sowie gentechnisch veränderten Zellen oder Tiermodellen.
Derzeit steht der Kraftstoff vor mehreren experimentellen Herausforderungen. In einem Skelettmuskel ist der ordnungsgemäße Transport und die Kommunikation zwischen CaV1.1 und RyR1 sowie vielen regulatorischen Proteinen entscheidend, um die Kopplung von Erregung und Kontraktion zu unterstützen. Die Methoden, um diese Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen CaV1.1 und RyR1 direkt zu untersuchen, fehlen oder sind unvollständig.
Das Labor von Dr. Martin Schneider beschäftigt sich seit Jahrzehnten mit der Anregungs-Kontraktions-Kopplung und charakterisiert Spannungsmessmechanismen in CaV1.1, die Freisetzung von Kalzium und lokale Kalziumfreisetzungsereignisse, die als Kalziumfunken bekannt sind. In jüngster Zeit hat unser Labor neue optische Techniken implementiert, um verschiedene Schritte der Erregungs-Kontraktions-Kopplung und der Bewegung von Spannungssensoren in funktionierenden erwachsenen Muskelzellen zu untersuchen. Während dies bisher in einem heterologen Expressionssystem durchgeführt wurde, erlaubt unser Protokoll nun die Verfolgung von Konformationsänderungen in CaV1.1-Spannungssensoren während eines sich ausbreitenden Aktionspotentials in seiner natürlichen Umgebung.
Unsere neue Technik wird es uns ermöglichen, die genaue Bewegung des Spannungssensors zu untersuchen, die für die Anregungs-Kontraktions-Kopplung benötigt wird. Wir wollen wissen, welche Ladungsreste in jedem S4 für seine Funktion entscheidend sind, oder genau jedes S4 translozieren, und all diese Translokation ist mit der Öffnung von CaV1.1 oder der Aktivierung des Ryanodinrezeptors verbunden.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Bewegung von Spannungssensoren in den spannungsabhängigen Kalziumkanälen vom Typ Kv1.1, die für die Elektromechanische Kopplung in murinem Skelettmuskelgewebe von entscheidender Bedeutung sind. Mithilfe der funktionellen gezielten Fluorometrie ermöglichen es die Forschenden, die Bewegungen dieser Proteindomänen in ihrem nativen zellulären Kontext in Echtzeit zu verfolgen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Erregungs-Kontraktions-Kopplung
- Spannungsabhängige Ionenkanäle
- Proteindomänen-Bewegungen
Hintergrund
- Kv1.1 verfügt über vier unterschiedliche Spannungssensoren, die mit der Kalziumsignalübertragung verknüpft sind.
- Das Verständnis ihrer genauen Funktionen könnte Mechanismen hinter der Muskelkontraktion aufklären.
- Frühere Methoden waren nicht in der Lage, diese Dynamiken in nativen Umgebungen zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Funktionelle ortsspezifische Fluorometrie
- Murine Skelettmuskel-Fasern
- Markierung mit fluoreszierenden Proteinen und Aufzeichnung ionischer Ströme
Hauptergebnisse
- Echtzeit-Verfolgung von Spannungssensorbewegungen während Aktionspotenzialen.
- Konfigurationsänderungen der Kv1.1-Spannungssensoren in Zusammenhang mit der Erregungs-Kontraktions-Kopplung.
- Bestätigung der Wirkung spezifischer geladener Reste auf die Funktion des Spannungssensors.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert Einblicke in das dynamische Verhalten von Spannungssensoren, die für die Muskelaktivität entscheidend sind.
- Diese Methodik vertieft das Verständnis sowohl der normalen Physiologie als auch von Krankheitszuständen im Zusammenhang mit der Muskelexzitation.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die funktionelle ortsgenaue Fluorometrie in nativen Muskelzellen ermöglicht die Echtzeitanalyse konformationeller Veränderungen spannungsabhängiger Ionenkanäle und liefert damit direkte Hinweise für die Validierung früher Zielstrukturen sowie die mechanistische Risikominderung in der Forschung zur Muskelexzitabilität. Dieser Ansatz schließt die Lücke zwischen heterologen Systemen und physiologisch relevanten Modellen und erhöht die Vorhersagesicherheit für auf Ionenkanäle abzielende Wirkstoffkandidaten. Ihre Integration unterstützt fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen in Entdeckungs- und präklinischen Entwicklungsprozessen, die auf neuromuskuläre Erkrankungen und Kanalopathien ausgerichtet sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Spannungssensorfunktion in nativen Muskelzellen zur robusten Zielvalidierung.
- Klärt den mechanistischen Beitrag spezifischer Kanaldomänen zur Erregungs-Kontraktions-Kopplung auf.
- Unterstützt die Vorhersagegenauigkeit, indem strukturelle Umgestaltungen mit funktionellen Ausgaben in krankheitsrelevanten Systemen verknüpft werden.
- Erleichtert die biologische Risikominimierung, indem die Zielinteraktion in physiologisch relevanten Kontexten bestätigt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Muskel-Fasersysteme für die nachgeschaltete Identifizierung von Modulatoren vor, die die Konformation oder Funktion von Kanälen beeinflussen.
- Ermöglicht quantitative, reproduzierbare Fluoreszenz- und elektrophysiologische Messungen zur Standardisierung von Assays.
- Unterstützt Skalierbarkeit und Wiederverwendung der Plattform, indem das Protokoll auf andere Ionenkanäle und Proteine angepasst wird.
- Verbessert die Zuverlässigkeit der Wirkstoffbewertung durch Integration von Echtzeit-Messungen struktureller und funktioneller Parameter.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Übereinstimmung mit krankheitsrelevanten Modellen durch die Verwendung adulten murinen Muskelzellfasern für eine translationale Kontinuität.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem mechanistische Einblicke in Defekte der Erregungs-Kontraktions-Kopplung bereitgestellt werden.
- Unterstützt die Abstimmung von Biomarkern durch quantitative Messung der Dynamik von Spannungssensoren, die mit funktionellen Ergebnissen verknüpft sind.
- Reduziert das Risiko in präklinischen Programmen, die auf Ionenkanalopathien abzielen, indem mechanistische Hypothesen im nativen Gewebe validiert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zu präklinischen mechanistischen Studien, insbesondere für Programme zur Ionenkanal- und Muskelexzitabilitätsforschung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch direkte Messung von Spannungssensor-Bewegungen während Aktionspotentialen.
- Screening: Bietet für Assays bereite, reproduzierbare Systeme mit quantitativen Fluoreszenz- und Stromsignalen.
- Analytik: Ermöglicht zeitaufgelöste, quantitative Messungen konformationeller Veränderungen zur vergleichenden Analyse unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Gewährleistet Kontinuität durch die Verwendung nativer Muskelfasern und unterstützt die Einordnung von Biomarkern und Krankheitsmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform, die an andere Ionenkanäle und Membranproteine in Muskel- und erregbaren Geweben angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung von Ionenkanal-Zielen.
- Operativer Wert: Verbessert Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit funktioneller Assays in nativen Systemen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzung, indem frühzeitige mechanistische Ent风险ierung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Programmen, die auf Ionenkanäle und Muskulatur abzielen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrophysiologie, Fluoreszenzbildgebung und Molekularbiologie für die Konstruktgestaltung und Dateninterpretation.
- Benötigt spezialisierte Instrumentierung zur simultanen Aufzeichnung von Fluoreszenz und Strom in Muskelzellen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um die Reproduzierbarkeit bei verschiedenen Ionenkanalzielen und Konstrukten zu gewährleisten.
- Die Anpassung an andere Modellsysteme könnte eine Optimierung der Transfektions- und Markierungsprotokolle erfordern.
- Mögliche Einschränkungen umfassen Hintergrundanfärbungen und Bewegungsartefakte, die sorgfältige experimentelle Kontrollen notwendig machen.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:55
Construct Design for Transfecting Cysteine‐Engineered Voltage‐Gated Ca2+ Channels in Murine Isolated Skeletal Muscle Fibers
4:05
Assessment of EGFP‐Positive Fiber Electrical Activity, Cysteine Staining, and Signal Acquisition
