Standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator
2. Juli 2009
Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für die Gewebe-Agitation um ein hohes Volumen an lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf das Lungengewebe erklärt.
In diesem Video-Protokoll sehen Sie, wie man Lungengewebe von erwachsenen Mäusen mit gentle max nach der Dissoziation des Lungengewebes abspaltet. In Gegenwart von Kollagenase D und DNase werden Zellsuspensionen durch einen 70-Mikron-Zellsieb-Zentrifugenfilter geleitet und für weitere Anwendungen suspendiert. Hallo, ich bin Melanie Mlu von Mil Biotech in Deutschland.
Heute zeige ich Ihnen ein reproduzierbares und automatisiertes Verfahren zur Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus Maus-Lungengewebe unter Verwendung der GenX-Dissociation. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Einzelzell-Suspensionen für die Gewinnung von Leukozyten oder endothelialen Zellen vorzubereiten. Gut, fangen wir an.
Bevor wir mit dem Protokoll beginnen, müssen einige Standardlösungen vorbereitet und bereitgestellt werden. Zunächst benötigen wir HEPES-Puffer. Zweitens eine Kollagenase-D-Lösung, die 100 Milligramm pro Milliliter Enzym und HEPES-Puffer enthält.
Drittens eine Dase-One-Lösung mit 20.000 Einheiten pro Milliliter Dase One. Zuletzt zwei gängige Pufferlösungen: ein typischer PBS-Puffer bei pH 7,2 und ein PEB-Puffer, abgeleitet von der AutoMax-Spüllösung und der BSA-Standardlösung.
Wir beginnen unser Protokoll mit einer dissezierten Lunge, die von einer sechs bis sieben Wochen alten weiblichen Biopsiemaus stammt. Stellen Sie sicher, dass die Lunge frei von benachbarten Organen wie Herz und Thymus, ausgehenden und eingehenden Blutgefäßen, Luftröhre und Bindegewebe ist. Spülen Sie das Gewebe in einer Petrischale mit PBS, um Erythrozyten zu entfernen.
Typischerweise wiegt eine Mauslunge in diesem Alter zwischen 110 und 150 Milligramm. Wenn Sie Lungen von älteren Tieren oder anderen Mausstämmen verwenden möchten, wiegen Sie das Gewebe und den Puffer. Pro Gefäß können maximal 450 Milligramm Gewebe dissoziiert werden.
Überführen Sie das Lungengewebe in eine Gentle-Max-C-Schläuche, die mit 4,9 Milliliter HEIS-Puffer beladen ist. Geben Sie 100 Mikroliter Kollagenase-D-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter im Lungengewebe und Puffer zu erreichen. Nun 10 Mikroliter DASE.
Eine Lösung für mehr als 150 Milligramm Gewebe. Geben Sie 20 Mikroliter Dase-Einlösung hinzu. Stellen Sie sicher, dass die C-Röhre fest verschlossen ist, und legen Sie sie verkehrt herum auf den Gentle Max-Dis.
Stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe zwischen Rotator und Stator befindet. Wählen Sie das Lungenprogramm aus und starten Sie es, indem Sie am Ende des Programms die Starttaste drücken. Entfernen Sie das C-Gefäß vom Gerät und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang.
In einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator sollte das Röhrchen während der Inkubation mit dem Max-Mix-Röhrchenrotator rotiert oder manuell alle fünf Minuten gedreht werden. Nach der Inkubation bringen Sie das C-Röhrchen in den sanften Max Associator zurück und führen das zweite Lungenprogramm aus. Während das Programm läuft, bereiten Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen zur Sammlung der gefilterten Zellen vor, indem Sie die Kappe durch einen Zellfilter mit 70-Mikrometer-Maschenweite ersetzen. Sobald das Dissoziierungsprogramm beendet ist, können Sie je nach Verteilung des Probenmaterials im Röhrchen das Röhrchen kurz zentrifugieren, um das Probenmaterial zu konzentrieren.
Die dissoziierten Zellen können durch Pipettieren durch die septumversiegelte Kappe des C-Gefäßes aus dem Gefäß entfernt werden. Unter Verwendung einer geeigneten 1000-Mikroliter-Pipettenspitze wird die Zellsuspension auf den Zellsieb aufgetragen, um größere Partikel oder Aggregate zu entfernen. Nachdem die Lösung abgelaufen ist, wird der Zellsieb gewaschen, indem weitere fünf Milliliter Puffer mit Raumtemperatur und Hees-Puffer hinzugefügt werden, um die filtrierten Zellen zu pelletieren.
Zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen bei 300 ×g für 10 Minuten. Aspirieren Sie nun den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in dem gewünschten Volumen PEB-Puffer bei Raumtemperatur.
Das Überstand nicht dekantieren. Sie können nun mit Ihrer nachgeschalteten Anwendung fortfahren. Die Dissoziation von Mauslungen-Gewebe mit diesem Verfahren liefert einen hohen Prozentsatz an vitalen Leukozyten und endothelialen Zellen.
Die gewonnenen Einzelzell-Suspensionen wurden mit CD 45 PE sowie CD 1 46 FITC oder CD 31 FITC gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Diese Darstellung zeigt die Anreicherung von dendritischen Zellen unter Verwendung von CD 11 C-Mikroperlen, einem Minimax-Separator und zwei MS-Säulen. Gut. Ich habe Ihnen soeben gezeigt, wie man auf standardisierte Weise Einzelzell-Suspensionen aus Mauslungen-Gewebe unter Anwendung der sanften Misch-Dissociation und C-Röhrchen herstellt.
Diese Methode ermöglicht die effiziente und genaue Gewebe-Dissociation. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Lunge korrekt zu dissezieren und das Gewebe unmittelbar nach der Dissektion weiterzuverarbeiten. Die hergestellten Einzelzell-Suspensionen können anschließend für weitere Experimente verwendet werden.
Zum Beispiel die magnetische Markierung der Zellen und anschließend die Trennung von Leukozyten oder endothelialen Zellen. Gut, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Video-Protokoll demonstriert die Dissoziation von Lungengewebe erwachsener Mäuse unter Verwendung des gentleMACS-Dissoziators. Das Verfahren dient der Gewinnung einer hohen Menge an lebensfähigen, kultivierbaren Zellen für weitere Anwendungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Techniken zur Zelldissoziation
- Herstellung von Einzelzell-Suspensionen
- Analyse von Maus-Lungengewebe
Hintergrund
- Die Dissoziation von Zellen aus Geweben erfordert spezifische Parameter.
- Der gentleMACS-Dissoziator bietet ein optimiertes Protokoll.
- Collagenase D und DNase werden im Dissoziationsprozess verwendet.
- Gefilterte Zellsuspensionen werden für weitere Anwendungen vorbereitet.
Zweck der Studie
- Eine reproduzierbare Methode zur Herstellung von Einzelzell-Suspensionen demonstrieren.
- Die Untersuchung von Leukozyten und endothelialen Zellen erleichtern.
- Einen praktischen Protokollansatz für Forscher auf diesem Gebiet bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Verwendung des gentleMACS-Dissociators zur Gewebeagitation.
- Anwendung von Kollagenase D und DNase während der Dissociation.
- Filterung der Zellsuspensionen durch einen 70-Mikron-Zellsieb.
- Zentrifugation und Resuspension der Zellen für weitere Anwendungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Dissoziation von Maus-Lungengewebe in Einzelzell-Suspensionen.
- Hohe Menge an lebensfähigen, kultivierbaren Zellen gewonnen.
- Protokoll zeigte Reproduzierbarkeit und Effizienz.
- Vorbereitung geeignet für nachgeschaltete Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Der gentleMACS-Dissociator ist wirksam für die Dissoziation von Lungengewebe.
- Diese Methode kann auf verschiedene Gewebetypen angewendet werden.
- Bietet ein wertvolles Werkzeug für Forschende, die Lungengewebe untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die standardisierte Gewebe-Dissociation ist ein entscheidender vorgeschalteter Schritt in der Immunologie- und Gefäßbiologieforschung und ermöglicht die reproduzierbare Herstellung von primären Zellsuspensionen für nachgeschaltete Analysen. Der gentleMACS Dissociator bietet ein automatisiertes, schonendes und skalierbares Verfahren zur Erzeugung von Einzelzell-Suspensionen mit hoher Vitalität aus Maus-Lungengewebe und unterstützt so eine konsistente Probenvorbereitung für die Durchflusszytometrie, Zellsortierung und molekulare Profilierung. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit in Target-Validierungsstudien, indem sie die Variabilität der Zellausbeute und -vitalität zwischen Experimenten verringert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Leukozyten- und Endothelzellpopulationen im Lungengewebe zur Überprüfung spezifischer Hypothesen.
- Operativer Wert: Verringert die manuelle Variabilität bei der Gewebeverarbeitung und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren und Zeitpunkten.
- Prädiktiver Wert: Gewährleistet eine konsistente zelluläre Ausgangsprobe für die Durchflusszytometrie und Zellsortierung und erhöht damit die Zuverlässigkeit der Ergebnisse bei der phänotypischen Analyse.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt gefilterte, frei von Verunreinigungen liegende Suspensionen, die für Antikörperfärbungen und durchflussbasierte Assays geeignet sind.
- Operativer Wert: Standardisierte enzymatische Verdauung und mechanische Dissoziation gewährleisten eine konsistente Zellausbeute von Charge zu Charge.
- Eignung für Assays: Erzeugt Suspensionen, die mit nachgeschalteten Anwendungen wie magnetischer Markierung und Zellseparation kompatibel sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung der Dynamik von Immun- und Gefäßzellen im Lungengewebe.
- Unterstützung präklinischer Modelle: Ermöglicht die Isolierung primärer Zellen aus murinen Lungen zur mechanistischen Absicherung therapeutischer Zielstrukturen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Zuverlässige Zellpräparation unterstützt konsistente Biomarker-Analysen und funktionelle Validierungen in präklinischen Arbeitsabläufen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der gentleMACS-Dissociator integriert sich als standardisierter Probenvorbereitungsschritt zwischen der Gewinnung von Gewebe und der zellulären Analyse in den Entdeckungsworkflow und ermöglicht einen zuverlässigen Übergang von ex vivo-Gewebe zu für Assays geeigneten Einzelzellen.
- Entdeckungsbioanalyse: Unterstützt die hypothesengeleitete Isolierung lungenspezifischer Immun- und Stromazellen zur Analyse zellulärer Signalwege.
- Screening: Erzeugt reproduzierbare Zellsuspensionen für phänotypische Hochdurchsatz- oder Durchflusszytometrie-basierte Screenings von Immunmodulatoren.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Durchflusszytometrie-Auswertungen (z. B. CD45+, CD31+) zum Vergleich experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet murine Lungenmodelle mit humanrelevanten Studien an Immun- und endothelialen Zellen durch standardisierte Probenvorbereitung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das vorkonfigurierte Lungenprotokoll des Geräts ermöglicht die Nutzung über verschiedene Projekte hinweg, die pulmonale Entzündungen, Fibrosen oder Infektionen untersuchen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Hohe Vitalität und Reinheit von Leukozyten und endothelialen Zellen verbessern die Datenqualität in nachgeschalteten Anwendungen.
- Operativer Wert: Automatisierung reduziert die manuelle Bearbeitungszeit und die vom Anwender abhängige Variabilität bei der Gewebedissoziation.
- Strategischer Wert: Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf konsistenten Zellausbeuten und Vitalitätskennzahlen.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen, indem zuverlässige primäre Zellpräparationen für die Validierung bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert eine Schulung in aseptischer Gewebe-Dissektion und enzymatischer Handhabung.
- Hängt von der Verfügbarkeit eines gentleMACS Dissociators mit lungspezifischem Programm und C-Röhrchen ab.
- Erfordert die Standardisierung der Enzymkonzentrationen (Kollagenase D, DNase) und Pufferbedingungen zwischen verschiedenen Anwendern.
- Kann je nach Mausstamm, Alter oder Krankheitsmodell, die die Gewebedichte beeinflussen, einer Anpassung bedürfen.
- Auf Gewebe beschränkt, die für eine enzymatische Dissoziation geeignet sind; bei faserigen oder verkalkten Proben könnten mechanische Alternativen notwendig sein.
