Antifouling Selbstorganisierte Monoschichten auf Mikroelektroden für die Strukturierung von Biomolekülen

Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung einer Mikroelektrode auf einem Silikon-Substrat. Eine selbstassemblierende Monoschicht aus Polyethylenglykol wird über der Mikroelektrode und dem Substrat gebildet, um die Ablagerung von Mikrotubuli zu verhindern. Anschließend werden mit Rumine markierte Mikrotubuli hergestellt.

Schließlich werden Mikrotubuli mithilfe der Elektrophorese auf die strukturierten Elektroden aufgebracht. Hallo, ich bin John Noel aus dem Nana-Labor der Fakultät für Physik und aus dem Labor für molekulare Biomechanik der Fakultät für Biomedizinische Technik an der Texas A&M University. Ich bin Wil free Teza aus der Physikabteilung und Direktor des Centers für Skill Science und Technologie an der Texas A&M University.

Und ich bin Juan Quang, Leiter des Labors für molekulare Biomechanik am Department für Biomedizinische Technik der Texas A&M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Mikroelektroden, die mit einer nicht anhaftenden, selbstassemblierenden Monoschicht beschichtet sind. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Mikroröhrenbewegungen mittels Elektrophorese zu untersuchen.

Beginnen wir nun. Verwenden Sie zunächst einen Scribe oder Wafer-Schneider, um Siliziumwafer in Stücke von einem Zentimeter mal 1,5 Zentimeter zu schneiden, die als Substrate dienen. Reinigen Sie nun die Substrate, indem Sie sie in ein Becherglas mit ausreichend Aceton geben, sodass sie bedeckt sind, und zehn Minuten lang beschallen, ohne dass die Substrate austrocknen dürfen.

Spülen Sie sie mit frischem Aceton und anschließend unmittelbar mit Isopropanol, und trocknen Sie sie mit Stickstoff. Stellen Sie mithilfe der standardmäßigen positiven Photolithographie oder der Elektronenstrahllithographie die Gold-Mikroelektroden auf den gereinigten Substraten her. Halten Sie beim Entwurf der Mustergeometrie den Durchmesser jedes Elektrodenmusters unter 100 Mikrometern. Um eine vollständige Bedeckung durch die aus Polyethylenglycol-Trimethoxysilan gebildete selbstorganisierte Monoschicht (PEG-SAM) sicherzustellen, schließen Sie Kontaktflächen ein, die 300 bis 500 Mikrometer vom Muster entfernt liegen, verbunden mit der Elektrode durch eine ein Millimeter breite Leiterbahn.

Nach der Entwicklung des Musters in der Resist-Schicht verwenden Sie eine Pinzette, um eine Linie vom Kontaktfeld bis zur Kante des Substrats in den Resist einzugraben. Bei der Metallabscheidung ermöglicht die Kerbe den elektrischen Kontakt zwischen der Elektrode und der Kante des Substrats. Eine Abscheidungskammer, vorzugsweise mit zwei Quellen, wird verwendet, um die Metallschicht abzuscheiden.

Die Elektroden werden durch Abscheidung von zwei Nanometern Chrom und anschließend sechs Nanometern Gold gebildet. Ohne das Vakuum zu brechen, kann ein im Reaktionsgefäß integrierter Quarz-Mikrowaage zur Messung der Schichtdicke während der Abscheidung verwendet werden. Nun kann man im gut belüfteten Bereich mit der Herstellung der selbstassemblierten Monoschicht beginnen und einen Ofen auf 75 Grad Celsius vorheizen. Bereiten Sie die Silanisierungslösung vor, indem Sie ein Milliliter PEG-Silane zu 20 Millilitern Toluol in einem 250-Milliliter-Glaskolben hinzufügen.

Mischen Sie gründlich durch fünf bis zehnmaliges Auf- und Abpipettieren und rühren Sie anschließend 30 Sekunden lang mit der Pipette. Legen Sie die Mustermuster mit der Musterseite nach oben in das Becherglas, wobei Sie sicherstellen müssen, dass sie vollständig in der Lösung eingetaucht sind und gleichmäßig über den Boden des Becherglases verteilt sind. Stellen Sie das Becherglas in den Ofen und backen Sie es 18 bis 21 Stunden lang, während das Sam gebildet wird.

Bereiten Sie die Gegenelektrode vor, indem Sie ein Nanometer Chrom und anschließend vier Nanometer Gold auf einen 22 mal 50 Millimeter großen Glasobjektträger aufdampfen. Die Gegenelektrode sollte nahezu transparent mit einem hellgrauen oder rosafarbenen Stich sein. Lagern Sie die Gegenelektrode mit der beschichteten Seite nach oben in einer Petrischale, um sie sauber zu halten.

Nach 18 bis 21 Stunden im Ofen den Becher aus dem Ofen nehmen. Das Toluol sollte verdunstet sein und die Mustermuster in einem viskosen Peg-Cline-Rückstand hinterlassen haben. Geben Sie 20 Milliliter Toluol in den Becher und lassen Sie die Proben ein bis zwei Minuten lang darin einweichen.

Entfernen Sie die Proben aus dem Becher und spülen Sie sie mit Toluol, dann mit Isopropanol ab und trocknen Sie sie abschließend mit Stickstoff. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Proben sauber aussehen, und die SAM-Schicht sollte mit bloßem Auge unsichtbar sein. Auf diese Weise hergestellte SAMs sind bis zu zwei Tage lang verwendbar, wenn sie bei kühlen und trockenen Bedingungen gelagert werden.

Eine erfolglose SAM-Bildung führt zu einem trüben oder ungleichmäßig gefärbten Rückstand, der die Oberfläche bedeckt. Nachdem die SAMs hergestellt wurden, können wir nun die Polymerisation von Tubulin in Mikrotubuli beginnen. Beginnen Sie damit, unmarkiertes Tubulin und rhodamintubulin aufzutauen und mischen Sie sie unverzüglich im Verhältnis von zwei Teilen unmarkiertem zu einem Teil markiertem Tubulin, um helle Mikrotubuli zu erhalten.

Mischen Sie sie gründlich, indem Sie mehrmals auf- und abpipettieren. Anschließend lassen Sie das Tubulin 20 bis 40 Minuten lang in einem temperierten Wasserbad bei 37 Grad Celsius polymerisieren, während das Tubulin polymerisiert. Bereiten Sie einen Pipes-Taxol-Puffer zu, indem Sie 20 Mikromolar Taxol mit Pipes-Puffer mischen.

Mischen Sie gründlich durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und Vortexen und stellen Sie das Röhrchen anschließend in ein temperiertes Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Verdünnen Sie nach der Polymerisation die Mikrotubuli in warmem Pipee-Taxol-Puffer und schützen Sie sie vor Licht. Überprüfen Sie, ob die Mikrotubuli-Polymerisation erfolgreich war und ob die Mikrotubuli mehrere Minuten lang stabil unter Fluoreszenzanregung bleiben.

Unter Verwendung eines Sauerstoff-scavengenden Gemischs erfolgt die Bildgebung der präparierten Mikrotubuli, nachdem die Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli abgeschlossen ist. Beginnen wir mit der Mustersetzung des MTS mittels Elektrophorese. Schneiden Sie zunächst ein Stück doppelseitiges Klebeband in dünne Streifen, indem Sie es auf einen Objektträger legen und mit einer Rasierklinge schneiden. Bringen Sie zwei Streifen des doppelseitigen Klebebands quer über die strukturierte, Sam-beschichtete Probe an, sodass sich die Elektrode zwischen den Streifen befindet und der Verbindungsweg senkrecht zu dem Klebeband verläuft.

Platzieren Sie die Gegenelektrode auf dem doppelseitigen Klebeband, sodass die Metallseite die Klebefläche berührt und die Probe etwa drei Millimeter über die Gegenelektrode hinausragt. Schneiden Sie mehrere 15 Zentimeter lange Stücke isolierten Kupferlackdrahtes ab und entfernen Sie jeweils einen Zentimeter der Isolierung an beiden Enden. Befestigen Sie mithilfe eines kleinen Tropfens Silberlack einen Draht an der freiliegenden Goldfläche des Substrats, wobei darauf geachtet werden muss, dass kein elektrischer Kontakt zur Gegenelektrode entsteht.

Tragen Sie nun mit Silberlack einen zweiten Draht am Gegenelektrodenanschluss an. Mit Silberlack befestigte Elektrodenadern können zusätzlich mit Klebeband an den Proben fixiert werden. Geben Sie anschließend mit einer Pipette Mikrotubuli in der gewünschten Verdünnung auf die Probe, betrachten Sie sie mit 20-facher Vergrößerung und lokalisieren Sie das Muster auf dem Siliziumwafer, bevor Sie eine Spannung anlegen.

Wegen der Tiefe der Durchflusskammer können Objektive mit großer Arbeitsweite erforderlich sein, um die obere Oberfläche der Durchflusskammer abzubilden. Der Abstand von der Probenoberfläche zur oberen Oberfläche der Durchflusskammer wird durch die Dicke des Klebebands bestimmt und sollte etwa 60 bis 100 Mikrometer betragen. Legen Sie eine Spannung von bis zu einem Volt an und beobachten Sie die Migration der Mikrotubuli.

Wenn eine reversible Einfangung von Mikrotubuli gewünscht ist, verwenden Sie Nagellack, um die Durchflusskammer abzudichten, um seitliches Verschieben zu verhindern, und nutzen Sie niedrigere Spannungen bis etwa 0,5 Volt. Die Wanderung kann verfolgt werden, indem die Fokusebene des Mikroskops in vertikaler Richtung angepasst wird; bei angelegten Spannungen von etwa 0,9 bis 1,2 Volt lagern sich die Mikrotubuli an den Elektrodenoberflächen an.

Eine höhere Spannung beschleunigt die Migration und verstärkt die Adhäsion, doch eine übermäßige Spannung führt zur Elektrolyse und Depolymerisation. Mikrotubuli: Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man SAM-beschichtete Mikroelektroden für die Mustersetzung von Mikrotubuli vorbereitet, da die SAM-Beschichtung die Absorption von Mikrotubuli an den Mikroelektroden verhindert. Dieses Verfahren kann ebenfalls für die reversible Mustersetzung von Mikrotubuli verwendet werden.

Außerdem ist dieser Prozess nicht nur auf Mikrotubuli beschränkt, sondern kann auch allgemein zur Mustergestaltung von Biomolekülen verwendet werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.