Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein zweidimensional strukturiertes Substrat zur Steuerung der Proteinadsorption und des Zellwachstums zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem mittels Photolithographie eine strukturierte Master-Vorlage hergestellt wird, die zur Herstellung eines A-P-D-M-S-Stempels für das Mikrokontaktdruckverfahren dient. Im zweiten Schritt wird das strukturierte Goldsubstrat vorbereitet, wozu das Mikrokontaktdruckverfahren genutzt wird, um ein Muster mit Bereichen zu erzeugen, die Protein adsorbieren beziehungsweise die Proteinadsorption resistieren.

Anschließend werden Protein und Zellen zum Substrat hinzugefügt, um das Muster zu visualisieren und zu untersuchen. Es werden Ergebnisse zum zellulären Wachstum und Verhalten erhalten, die eine gute Protein- und Zellkonfinierung auf diesen strukturierten Substraten mittels Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen etablierten Methoden, wie beispielsweise dem MicroContact Printing von Proteinen, liegt darin, dass die glykolterminierte Monoschicht eine unspezifische Protein- und Zelladsorption im Hintergrund des Musters verhindert.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die geeignete Stempeltechnik für jedes gedruckte Muster optimiert werden muss. Um mit der Vorbereitung des strukturierten Master-Zentrums zu beginnen, spülen Sie während des ersten Schritts des zweistufigen Spin-Programms die Siliziumscheibe auf dem Spin-Beschichter mit Aceton. Während des zweiten Schritts des Spin-Programms verdunstet das Aceton, wodurch zu Beginn des Spins eine saubere, trockene Scheibe entsteht; tragen Sie anschließend Photoresist auf die Scheibe auf und führen Sie die Spin-Beschichtung unter den zuvor beschriebenen Bedingungen durch.

Die mit Fotolack beschichtete Wafer bei 110 Grad Celsius für zwei Minuten mit einem hochuniformen Heizplattenofen weich aushärten. Als Nächstes das Fotomuster. Die mit Fotolack beschichtete Wafer mithilfe eines Maskenjustiersystems und einer geeigneten Maske belichten.

Platzieren Sie zunächst das Substrat auf dem Vakuumtisch des Maskenaligners. Danach setzen Sie die Maske in das Haltefach ein und schalten das Vakuum ein, um die Maske zu fixieren und einen guten Kontakt zwischen Maske und Substrat zu gewährleisten. Heben Sie das Substrat an, bis es die Maske berührt.

Verwenden Sie die Optik des Aligners, um zu überprüfen, ob ein guter Kontakt hergestellt wurde. Schalten Sie abschließend die Lampe ein, um das Substrat über die lithografische Maske UV-Licht auszusetzen. Entwickeln Sie den strukturierten Wafer eine Minute und 45 Sekunden lang im Entwickler unter leichtem Schütteln.

Gründlich mit wasserfreiem, halbleiterreinem Wasser spülen und mit einem Strom aus Stickstoffgas trocknen; überprüfen Sie die Musterentwicklung mithilfe eines Mikroskops mit UV-Filter. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie ein Harz-Härter-Gemisch im Gewichtsverhältnis von 10 zu 1 herstellen. Mischen Sie Cigar 180 2 vollständig.

Bedecken Sie den fotomusterbasierten Wafer in einer Einweg-Petrischale mit der Mischung unter Vakuum entgasen, bis keine Blasen mehr sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass der Master unten in der Schale liegt, und lassen Sie den Stempel anschließend 1,5 Stunden bei 65 Grad Celsius im Ofen aushärten. Nach dem Aushärten des PDMS-Stempels diesen vom Master ablösen und auf die geeignete Größe zuschneiden.

Bewahren Sie den Stempel in einem abgedeckten Behälter mit der Strukturseite nach oben auf, um ihn vor Staub und Verunreinigungen zu schützen. Um die Substrate für die Metallabscheidung vorzubereiten, behandeln Sie runde Glasdeckgläser zunächst 10 Minuten lang mit Sauerstoff-Plasma. Anschließend spülen Sie die Deckgläser zweimal mit entionisiertem Wasser ab, trocknen sie jeweils mit einem Strom aus Stickstoffgas zwischen den Spülgängen; nach dem Spülen mit Wasser spülen Sie erneut zweimal mit Ethanol und trocknen erneut mit einem Strom aus Stickstoffgas zwischen den Spülgängen.

Unter Verwendung eines Mehrfach-Taschen-Elektronenstrahl-Abscheidungssystems 50 Ångström Titan absetzen, gefolgt von 150 Ångström Gold. Den Verdampfer zwischen der Abscheidung der Titanschicht und der Goldschicht nicht belüften. Den PDMS-Stempel mit Ethanol spülen und gründlich trocknen.

Tragen Sie mit Stickstoffgas die Stempellösung tropfenweise auf den Stempel auf, bis dieser vollständig beschichtet ist. Trocknen Sie den Stempel gründlich mit Stickstoffgas. Das mikrokontaktlithografische Drucken der HEXA-Decan-Datei hängt von den Merkmalen des PDMS-Stempels ab und stellt einen der schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens dar.

Ein erfolgreiches Bedrucken erfordert die Entwicklung einer guten Technik, die gleichmäßigen Druck ausübt. Beim Bedrucken: Drücken Sie den Stempel bei der herkömmlichen Mikrokontaktdrucktechnik in Luft vorsichtig auf das Goldsubstrat und lassen Sie die Monoschicht 15 Sekunden lang bilden.

Alternativ, bei Mustern, die aus sehr kleinen Strukturen und hohen Aspektverhältnissen bestehen, das Goldsubstrat in eine Petrischale mit 18,2 Megaohm entionisiertem Wasser geben, wobei sichergestellt werden muss, dass das Substrat vollständig untergetaucht ist. Anschließend den Stempel vorsichtig auf das Goldsubstrat drücken und eine Monoschicht 15 Sekunden lang bilden lassen. Danach das gestempelte Substrat zweimal mit Ethanol spülen und mit Stickstoffgas trocknen.

Nach jedem Spülvorgang das Substrat in eine Petrischale geben und mit Rückfülllösung bedecken. Die Schale mit Parafilm abdichten, um Verdunstung zu verhindern. Die Hintergrund-Monoschicht 12 bis 14 Stunden im Dunkeln bilden lassen.

Entfernen Sie abschließend die strukturierte Deckglasabdeckung von der Hinterfüllungslösung und spülen Sie sie zweimal mit Ethanol, wobei nach jeder Spülung mit Stickstoffgas getrocknet wird. Um das Protein auf das strukturierte Deckglas aufzubringen, legen Sie das Deckglas entweder in eine kleine Petrischale oder eine Zellkulturkammer und bedecken Sie es mit 500 Mikrolitern bis einem Milliliter Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung. Die DPBS muss das Substrat während der Proteininkubation vollständig bedecken.

Um eine gleichmäßige Proteinbedeckung sicherzustellen, eine konzentrierte Proteinlösung dem DPBS hinzufügen und die Lösung mehrmals mit einer Pipette mischen. Die Proteinmischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit dem Substrat inkubieren. Nach der Inkubation das Substrat gründlich mit DPBS spülen, um ungebundenes Protein zu entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Substrat nicht austrocknet oder durch die Luft-Wasser-Grenzfläche bewegt wird.

Nach drei Spülgängen das DPBS absaugen. Anschließend etwa 500 Mikroliter vollständiges Zellwachstumsmedium hinzufügen, um ein feuchtes Substrat zu erhalten. Ersetzen Sie das zum Spülen des Substrats verwendete Wachstumsmedium.

Mit frischem Medium ist das Substrat nun bereit, mit Zellen beimpft zu werden. Typischerweise werden 30 bis 200 Zellen pro Quadratmillimeter auf das Substrat aufgebracht. Diese Aufnahme zeigt den A-P-D-M-S-Stempel, der unter dem Mikroskop sichtbar gemacht wurde, indem die strukturierte Seite des Stempels nach unten auf einen Glasdeckel platziert wurde; der Maßstabsbalken beträgt 100 Mikrometer.

Korrektes Stanzen führt zu einem scharfen, klaren Proteinmuster, das durch die Anwendung eines fluoreszenzmarkierten Proteins, wie beispielsweise LOR 6 47-markiertes Fibronectin, sichtbar gemacht werden kann. Hier ist die Einschränkung von chk one-Zellen auf das Proteinmuster dargestellt. Die Maßstabsbalken betragen in diesen Bildern 100 Mikrometer.

Alternativ kann die Immunhistochemie verwendet werden, um den Proteinaufbau nach SU-Fixierung sichtbar zu machen. Hier wird das mit LOR drei 50 konjugierte Antilaminin-Antikörper eingesetzt, um den mit E 18-Maus-Hippocampus-Neuronen besiedelten lamininbasierten Proteinaufbau darzustellen, der nach vier Tagen im Reagenzglas gezeigt wird. E 18-Maus-Hippocampus-Neuronen, gefärbt mit MIT Tracker Rot fünf 80, zeigen, dass das Zellwachstum gut auf den Proteinaufbau begrenzt ist. Obwohl diese Technik leicht erlernbar ist, können mehrere häufige Probleme auftreten, wie anhand dieser Muster-Substrat-Präparationen veranschaulicht, die mittels mit LOR sechs 47 konjugiertem Fibronectin-Absorptionsverfahren visualisiert wurden.

Die Applikation des Proteins ohne ausreichende Vermischung der konzentrierten Proteinslösung in DPBS kann zu ungleichmäßigen Proteinmustern führen. Eine unsachgemäße Abformung kann zu einer teilweisen Musterübertragung oder zum Einsturz des Stempels führen. Außerdem kann das Aussetzen des Musterträgers mit adsorbiertem Protein gegenüber Luft die Monoschicht stören und zu einer verminderten Resistenz führen.

Im Hintergrund kann die versenkte Musterverfahren kleine Strukturen erzeugen, die mit herkömmlichem Mikrokontaktdruck an Luft schwer zu drucken sind. Diese beiden Bilder zeigen unterschiedliche Bereiche desselben Musters, das mit demselben PDMS-Stempel an Luft bzw. in entionisiertem Wasser aufgebracht wurde. Die Stützlinien sind im linken Bild dargestellt, um zu zeigen, dass nur die kleinen Strukturen des Musters nicht erfolgreich übertragen wurden. Maßstabsbalken entsprechen 20 Mikrometern. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 18 bis 24 Stunden durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein strukturiertes Substrat herstellt. Stellen Sie einen A-P-D-M-S-Stempel her. Nutzen Sie das Mikrokontaktdruckverfahren, um ein strukturiertes Goldsubstrat herzustellen, und visualisieren Sie dieses Muster mithilfe von Proteinen und Zellen.