Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila

Hier werden zwei Techniken zur Visualisierung eines schlagenden Herzens bei Drosophila für die Dissektion des adulten Herzens vorgestellt. Zuerst werden Kopf und Thorax durch einen einzigen Schnitt entlang der angegebenen Linie entfernt. Anschließend werden die Genitalien entfernt und die Bauchhöhle mit einer Pinzette geöffnet; dabei werden der Darm und im Fall einer weiblichen Fliege auch die Ovarien entfernt.

Der abdominale Fettkörper in den Bauchsegmenten drei und vier wird vorsichtig abgesaugt, um das erwachsene Herz freizulegen und so das Larvenherz zu fixieren. Eine einzelne Larve, die in Pufferlösung platziert wurde, wird fixiert, indem zuerst Histo-Acral-Kleber im Kopfbereich der Larve aufgetragen wird. Die Larve wird sanft gestreckt, und weiterer Kleber wird am hinteren Ende sowie an den Flanken der Larvenkörperwand aufgetragen.

Hallo, ich bin GI Fler. Hallo, ich bin Karen er. Wir sind beide Mitglieder des Entwicklungs- und Alternsprogramms am Burnham Institut für Medizinische Forschung.

Heute zeigen wir Ihnen die Verfahren, die wir entwickelt haben, um das schlagende Herz von Larven und erwachsenen Drosophila sichtbar zu machen. Beide Präparationen nutzen wir, um Herzschlagparameter bei der Fruchtfliege Drosophila zu visualisieren, zu untersuchen und zu quantifizieren. Bevor wir beginnen, bereiten wir zunächst eine künstliche Hämolymphe-Lösung vor.

Diese Lösung enthält den Saccharose-Zusatz Helo, der kurz vor der Verwendung der künstlichen Hämolymphe aus gekühlten Stammlösungen zugesetzt werden sollte. Um bakterielle Kontaminationen zu vermeiden, bringen Sie die künstliche Hämolymphe auf Raumtemperatur und oxygenieren Sie die Lösung durch Einleiten von Luft mindestens 15 Minuten lang. Ziehen Sie anschließend mehrere feine Kapillaren mit einem standardmäßigen Pipettenzieher, die zum Entfernen der Fettkörper in der Fliege benötigt werden.

Nachdem alles vorbereitet wurde, müssen erwachsene Fliegen anästhesiert werden. Dies kann durch kurze Exposition gegenüber Fly Nap für zwei bis fünf Minuten erfolgen, wobei jedoch darauf geachtet werden muss, die Fliegen nicht länger als fünf Minuten dem Fly Nap auszusetzen. Eine kurzzeitige Kälteexposition kann ebenfalls zur Anästhesie der Fliegen verwendet werden, Kohlendioxid wird jedoch nicht empfohlen, da es länger anhaltende Auswirkungen auf die Herzfrequenz und die ity hat.

Anschließend werden die anesthetisierten Fliegen mit der dorsalen Seite nach unten in eine Petrischale gelegt, die mit einer dünnen Schicht aus Vaseline beschichtet ist. Die hydrophobe Cuticula an Flügeln und Körper sollte reversibel an der Vaseline haften, doch die Fliege kann bei Bedarf neu positioniert werden. Ein erster Schnitt wird mit einer gebogenen Schere mit Feder ausgeführt.

Dies erfolgt, indem die Scherenklingen unter die Beine der Fliege gelegt und in Richtung der dorsalen Oberfläche nahe dem Halsbereich geneigt werden. Kopf, ventraler Nervenstrang und Beine werden mit einem einzigen Schnitt entfernt. Die Präparation wird anschließend mit Federbändchen-Scheren in die mit Sauerstoff angereicherte künstliche Hämolymphe-Lösung getaucht.

Die Hinterseite des Abdomens, die aus dem siebten und achten Abdominalsegment besteht, wird mit einem einzigen Schnitt entfernt. Dies ermöglicht seitliche Schnitte entlang beider Kanten des Abdomens und durchtrennt die Verbindung zwischen dem hinteren Darm und der abdominellen Cuticula. Führen Sie die Scherenklingen in die kleine Öffnung an der Spitze des Abdomens ein und schneiden Sie die Cuticula seitlich entlang.

Dadurch wird eine Kante der ventralen Kutikula freigelegt. Greifen Sie die Lasche mit einer Pinzette und führen Sie einen ähnlichen Schnitt entlang der gegenüberliegenden lateralen Bauchkante durch. Die freigelegte Lasche der ventralen Bauchkutikula kann nun entfernt werden.

Der Darm und andere Bauchorgane können normalerweise als einheitliche Masse mithilfe einer feinen Pinzette und vorsichtigem Ziehen entfernt werden. Das Entfernen der inneren Organe legt das schlagende Herzröhrchen frei, das noch über kleine Herzmuskeln mit der dorsalen Cuticula verbunden ist und von Fettkörpern umgeben ist. Die herausgezogenen Kapillaren werden in einen Kunststoffschlauch mit einem Sechzehntel-Zoll-Durchmesser eingeführt, der an eine Vakuumquelle angeschlossen ist.

Die Saugkraft ist proportional zum Tip-Durchmesser, daher sollten Pipetten mit Spitzen, deren Durchmesser größer als 40 Mikrometer ist, nach der Einrichtung nicht verwendet werden. Dieses Saugsystem dient dazu, überschüssiges Fett um die Herzröhre herum abzusaugen. Es kann auch genutzt werden, um Luftblasen, die sich an der Kutikula sammeln, sowie jeglichen Schmutz zu entfernen.

Es ist äußerste Vorsicht geboten, um das Herz selbst nicht zu berühren, und da der hintere Bereich des Herzens sehr empfindlich ist, sollte auch dieser Bereich insgesamt gemieden werden. Die Herzzelle der erwachsenen Drosophila ist nun freigelegt und sollte gegebenenfalls schlagen. Das Cuticula-Stück mit dem daran befestigten Herzen kann umpositioniert werden, indem man die Cuticula vorsichtig aus dem Vaseline heraushebt und sie dann sorgfältig wieder andrückt.

Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit dem Herdgewebe. Zu diesem Zeitpunkt sollte die die Präparation umgebende Lösung durch frische künstliche Hämolymphe ersetzt werden. Die Präparation sollte vor weiteren Eingriffen 20 bis 30 Minuten unter Sauerstoffversorgung equilibrieren.

Wenn die Präparation länger als 60 Minuten aufrechterhalten werden soll, sollte sie mit frischem künstlichem Hämolymphe nachperfundiert werden. Diese Präparation ist nun bereit, für optische Ableitungen verwendet zu werden, und kann auch für elektrophysiologische Ableitungen oder histologische Bearbeitungen genutzt werden. Für die Visualisierung des schlagenden Herzens innerhalb der Larven ist eine andere Technik erforderlich.

Bereiten Sie zunächst die Deckgläser am Tag vor dem Eingriff vor. Dazu werden mit einem Zahnstocher etwa 50 bis 70 Mikroliter Sard-Lösung auf ein 22 mal 22 Millimeter großes Deckglas gegeben. Lassen Sie den Syl-Guard bei 65 Grad Celsius über Nacht aushärten.

Als Nächstes stellen Sie den Brody- und Bates-Puffer her; einmal hergestellt, können Aliquots bei minus 20 Grad Celsius gelagert und bei Bedarf aufgetaut werden. Schließlich bereiten Sie die Werkzeuge vor, die zum Auftragen des histoakryl-Klebers benötigt werden. Ziehen Sie zunächst mehrere feine Kapillaren.

Als Nächstes verbinden Sie eine 1,5-Milliliter-Pipettenspitze mit einem kleinen Kunststoffschlauch mit einem Durchmesser von etwa einem Zweiunddreißigstel Zoll. Stecken Sie das kleinere Ende in den Schlauch und führen Sie eine Kapillare mit ihrer weit geöffneten Seite in das andere Ende ein. Nach dem Zusammenbau füllen Sie die Kapillare mit Histo-Kleber, indem Sie die Kapillare in einen Tropfen Kleber eintauchen und vorsichtig Saugkraft über die Kunststoffspitze ausüben.

Beim Arbeiten mit dem Kleber sollte man eine zweite Glaskapillare bereithalten, um überschüssigen Kleber von der Spitze der Kleberkapillare zu entfernen. Der Kleber ist flüssig, bis er mit gepufferter Salzlösung in Kontakt kommt, wodurch er innerhalb weniger Sekunden aushärtet. Normalerweise bleibt er jedoch ausreichend lange plastisch, um von der Spitze der Kleberkapillare entfernt oder während des Auftragens auf die Probe verarbeitet werden zu können.

Um nun mit der Immobilisierung der Larven zu beginnen, geben Sie einen Tropfen Histo-Acral-Kleber nahe jeder Ecke des Syl-Guards auf. Decken Sie die Objektträger mit jeweils 50 Mikrolitern B-und-B-Puffer ab, der sofort in den Klebetropfen aushärtet. Füllen Sie den Raum zwischen den geklebten Stellen mit B und B. Der Kleber hält den Puffer auf dem Objektträger.

Nehmen Sie eine wandernde Larve im dritten Larvenstadium und legen Sie sie für zwei Minuten auf ein Stück feuchtes Filterpapier auf Eis. Dies verlangsamt ihre Bewegung. Anschließend überführen Sie die Larve in den Puffer und positionieren sie mit der dorsalen Seite nach oben.

Dies ist die Seite der Larven, die nicht über identische Gurte verfügt. Tragen Sie schnell etwas Klebstoff zwischen den Kopfbereich und die Türschwelle auf. Der Klebstoff härtet sehr schnell aus und verhindert, dass sich der Kopf der Larve bewegt.

Mit einer Pinzette vorsichtig das Tier an den hinteren Glanzstellen fassen und sanft dehnen. Die Larven in dieser Position fixieren, indem der Kleber entlang beider Seiten der Larven in der hinteren Hälfte aufgetragen wird. Um weitere Bewegungen der Cuticula durch die Muskulatur der Körperwand zu reduzieren, mehr Kleber an den Flanken des Tieres hinzufügen.

Die Larve ist nun in dieser Position fixiert. Der Deckglaser kann in eine kleine Petrischale, gefüllt mit künstlichem Hämolymphe oder PBS, gegeben werden; nun können Herzschläge ohne Störung durch Bewegungen der Körperwand aufgezeichnet werden. Das halbintakte Herz von erwachsenen Drosophila schlägt rhythmisch über mehrere Stunden nach der Präparation, sofern es in frischem, mit Sauerstoff angereichertem künstlichem Hämolymphe gehalten wird.

Ein repräsentatives Beispiel ist hier und im ergänzenden Film eins dargestellt: Herzen von dritten Instar-Larven, die hier gezeigt werden, sowie junge Fliegen im Alter von ein bis drei Wochen nach der Elosion zeigen im Allgemeinen einen regelmäßigen Herzschlag mit Frequenzen zwischen ein und drei Hertz. Fliegen, die älter als drei Wochen sind, zeigen im Allgemeinen eine stärkere Arrhythmie. Dennoch sind diese Herzen weiterhin in der Lage, stundenlang in oxygeniertem künstlichem Hämolymphe spontan zu schlagen. Herzen und erwachsene Fliegen, die infolge des Präparationsverfahrens beschädigt wurden, weisen typischerweise lokal begrenzte Bereiche starker Kontriktion auf, die sich nicht entspannen können und oft unkontrollierbar sind. Herzschlagfrequenzen unter einem Hertz werden bei Fliegen, die jünger als drei Wochen sind, selten beobachtet.

Daher gelten derartige Präparationen als beschädigt und werden verworfen. Wir haben soeben gezeigt, wie man ebene und adulte Fruchtfliegenherzen für die optische Bildgebung vorbereitet. Denken Sie daran, beim Anfertigen der halbintakten Präparation das Herz selbst niemals zu berühren.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.