Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos
11. Dezember 2010
Wir beschreiben das Verfahren zur Vorbereitung inszeniert Drosophila Embryonen für die Visualisierung des embryonalen Nervensystems während der Embryogenese.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Oph- und Melanogaster-Embryonen für die Ganzpräparat-Darstellung des Nervensystems vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen aus dem gewünschten Fliegenstamm gesammelt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Corium mit Bleiche zu entfernen.
Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Heptan und Methanol aufzutragen, um die Vilin-Membran zu entfernen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Applikation von Antikörpern auf die Embryonen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Struktur des Nervensystems des Drosophila-Embryos mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen.
Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise welche Rolle Mutationen im sich entwickelnden Nervensystem spielen können. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, haben in der Regel Schwierigkeiten, da sie versehentlich Embryonen aus dem Reagenzglas heraussaugen können. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die benötigten Reagenzien vorbereiten, darunter P-E-M-F-A, Puffer PBC mit 5 % BSA und 0,01 % Natriumazid in Salzlösung sowie Formaldehyd-Fixierungslösung.
Bereiten Sie einen Käfig für den gewünschten Drosophila-Stamm vor, indem Sie die Fliegen mit Kohlendioxid betäuben und anschließend mindestens 100 Fliegen in eine Plastikflasche überführen, die einen Adapter mit einer Futterplatte aus Apfelsaft-Agar enthält. Stellen Sie den Fliegenkäfig 72 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf. Wechseln Sie die Futterplatten aus Apfelsaft-Agar alle acht bis zwölf Stunden, damit sich die Fliegen an den Käfig gewöhnen und ihre Eier für das Experiment nicht zurückhalten.
Nach der 72-stündigen Eingewöhnungsphase sammeln Sie die Embryonen innerhalb von 12 Stunden nach dem letzten Austausch der Apfelsaft-Agar-Fütterungsplatte. Entfernen Sie die Apfelsaft-Agar-Fütterungsplatte aus dem Legkäfig und ersetzen Sie sie unter Verwendung von Kochsalzlösung. Spülen Sie die Apfelsaft-Agar-Fütterungsplatte aus.
Sammeln Sie die Embryonen in einem feinen Sieb. Lösen Sie mit einem sauberen Pinsel vorsichtig alle Embryonen, die noch an der Platte haften. Spülen Sie die Embryonen im Sieb mit Salzlösung ab, um überschüssige Hefe zu entfernen. Heben Sie die Embryonen vorsichtig mit einem Spatel auf und geben Sie sie in ein kleines Glasfläschchen.
Geben Sie etwa ein Milliliter Kochsalzlösung hinzu. Verschließen Sie dann das Gefäß und inkubieren Sie fünf Minuten lang, um die Embryonen zu waschen. Danach erfolgt die Sammlung der Embryonen.
Bereiten Sie die Heptan-Fixierlösung vor, indem Sie 50 % Heptan und 50 % Fixiermittel mischen. Die Lösung bildet eine Schichtung mit Heptan oben und dem Fixiermittel unten. Nach fünf Minuten entfernen Sie mithilfe einer Pasteurpipette die überschüssige Salzlösung aus dem Glasfläschchen mit den Embryonen.
Spülen Sie die Embryonen mit entionisiertem Wasser, indem Sie etwa ein Milliliter entionisiertes Wasser auf das Glasfläschchen mit den Embryonen auftragen. Lassen Sie die Embryonen eine Minute lang stehen, bevor Sie das Wasser abgießen und durch eine 50 %ige Bleichlösung ersetzen. Schütteln Sie das Fläschchen mehrmals von Hand und inkubieren Sie anschließend drei Minuten lang, um die Embryonen zu behandeln.
Die behandelten Embryonen sinken auf den Boden des Gefäßes. Embryonale CORs schwimmen oben. Entfernen Sie die Bleichlösung und die CORs nach der dreiminütigen Inkubation.
Nach der Dekoration die Embryonen gründlich mit entionisiertem Wasser spülen, wobei etwa ein Milliliter entionisiertes Wasser auf das Glasfläschchen mit den Embryonen gegeben wird. Die Embryonen eine Minute lang stehen lassen, bevor das überschüssige Wasser entfernt wird; verbliebene CORs schwimmen oben und sollten entfernt werden. Die Heptan-Fixierungslösung zu den Embryonen geben und diese 30 Minuten unter leichtem Schütteln inkubieren, um sie nach der Fixierung zu fixieren.
Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette das Fixans, das sich in der unteren Schicht befindet, und lassen Sie das Heptan im Reagenzglas. Geben Sie anschließend Methanol anstelle des Fixans in das untere Ende des Reagenzglases und verschließen Sie das Gefäß. Schütteln Sie es kräftig von Hand, um die Vitellinmembran zu entfernen. Danach werden die fixierten Embryonen auf den Boden des Reagenzglases absinken.
Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette das Methanol und die Hets aus dem Gefäß, wobei die entionisierten Embryonen zurückbleiben. Spülen Sie die Embryonen anschließend fünfmal mit Methanol, wobei das Methanol nach jeder Spülung mit einer Pasteurpipette abgenommen wird. Inkubieren Sie die Embryonen für jede Spülung jeweils fünf Minuten lang.
Die Embryonen fünf Minuten lang in eine Mischung aus 50 % PBT-Lösung und 50 % Methanol geben, um sie zu rehydrieren. Setzen Sie den Rehydratisierungsprozess fort, indem Sie die Embryonen für fünf Minuten in 100 % PBT-Lösung überführen. Blockieren Sie anschließend die Embryonen, indem Sie sie eine Stunde bei vier Grad Celsius in einer Lösung mit 5 % BSA und 0,01 % Natriumazid inkubieren.
Bereiten Sie als Nächstes das primäre Antikörper für die Embryonalanfärbung vor, indem Sie es in einer Lösung aus 5 % BSA mit 0,01 % Natriumazid auf die geeignete Konzentration verdünnen. Die hier verwendeten Antikörper richten sich gegen das vesikuläre Cystein-String-Protein und den Anti-HRP-Antikörper. Anti-HRP erkennt eine neuronenspezifische Kohlenhydratgruppe, die in den Oberflächenglykoproteinen vorkommt und alle Neuronen markiert.
Die Embryonen über Nacht bei vier Grad Celsius in der Primärantikörperlösung inkubieren. Die Embryonen zehnmal im Verlauf einer Stunde mit PBT waschen. Indem etwa ein Milliliter PBT auf das Glasgefäß mit den Embryonen gegeben wird, die Embryonen sechs Minuten lang ruhen lassen, bevor das PBT entfernt wird.
Wiederholen Sie diesen Vorgang des Auftragens von PBT, der Inkubation und des Entfernens von PBT insgesamt 10-mal. Bereiten Sie die Sekundärantikörper-Lösung im Dunkeln vor, da sie lichtempfindlich ist, indem Sie sie auf die geeignete Konzentration verdünnen. Wir verwenden Alexa-Sekundärantikörper in einer Konzentration von 1 zu 200.
Die Embryonen zwei Stunden bei vier Grad Celsius in der Sekundärantikörperlösung inkubieren. Das Glasgefäß mit den Embryonen und der Sekundärantikörperlösung mit Aluminiumfolie umwickeln, um eine Lichteinwirkung zu vermeiden. Die Embryonen im Verlauf einer Stunde zehnmal mit PBT waschen.
Geben Sie Vektor-Schutz-Mounting-Medium zu den Embryonen hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius zum Aufbringen. Verwenden Sie eine Pastellpipette, um die Embryonen zusammen mit etwas Mounting-Medium aufzusaugen. Tragen Sie die Embryonen und das Medium auf einen Objektträger auf.
Legen Sie einen Deckgläser über die Embryonen und verschließen Sie das Deckgläser mit Nagellack. Visualisieren Sie die Embryonen mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops hier. Das embryonale ZNS ist im Stadium 16 bis 17 dargestellt.
Cystin-Saite-Protein ist rot dargestellt. HRP-Neurone sind grün dargestellt. Beachten Sie die deutliche Färbung des Kommissurs in diesem repräsentativen Bild.
Das embryonale periphere Nervensystem ist im Stadium 16 bis 17 dargestellt. Wiederum wird das Cystin-Saure-Protein in Rot und die Neurone in Grün gezeigt. Beachten Sie die wiederholten Muster der peripheren Neurone.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, auf die Embryonen achtzugeben, um sie nicht versehentlich aus dem Röhrchen zu entfernen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man oph fla-Embryonen für die Ganzpräparat-Darstellung des Nervensystems vorbereitet.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein detailliertes Verfahren zur Herstellung von zeitlich gestaffelten Drosophila-Embryonen beschrieben, um das embryonale Nervensystem während der Embryogenese sichtbar zu machen. Die Methode umfasst mehrere Schritte, darunter die Sammlung der Embryonen, deren Fixierung und die Antikörperanfärbung, und ermöglicht schließlich die Beobachtung neuronaler Strukturen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Embryologie
Hintergrund
- Das Verständnis des embryonalen Nervensystems ist entscheidend für Erkenntnisse über Entwicklungsprozesse.
- Die Visualisierung neuronaler Strukturen kann helfen, die Auswirkungen genetischer Mutationen aufzuklären.
- Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung zellulärer Bestandteile.
- Eine sachgemäße Aufbereitung der Embryonen ist für erfolgreiche Abbildungsergebnisse unerlässlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur Visualisierung des Nervensystems in Drosophila-Embryonen.
- Unterstützung der Forschung zur Rolle von Mutationen bei der Entwicklung des Nervensystems.
- Verbesserung des Verständnisses der embryonalen neuronalen Struktur durch fortschrittliche Abbildungstechniken.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Embryonen aus spezifischen Drosophila-Stämmen.
- Verwendung von Bleiche und Heptan zur Entfernung der Membran und Fixierung.
- Anwendung von primären und sekundären Antikörpern für spezifische Färbungen.
- Sichtbarmachung der Embryonen mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung des embryonalen Nervensystems im Stadium 16.
- Nachweis der Wirksamkeit des Antikörper-Färbeprotokolls.
- Erkenntnisse zur strukturellen Organisation von Neuronen in sich entwickelnden Embryonen.
- Identifizierung potenzieller Herausforderungen für neue Forschende im Protokoll.
Schlussfolgerungen
- Das beschriebene Protokoll stellt eine umfassende Methode zur Untersuchung des embryonalen Nervensystems von Drosophila bereit.
- Die Immunfluoreszenzmikroskopie wird als wirksames Werkzeug für diese Forschung bestätigt.
- Zukünftige Studien können diese Methode nutzen, um genetische Einflüsse auf die Entwicklung des Nervensystems zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Visualisierung des embryonalen Nervensystems in ganzmontierten Drosophila-Embryonen ermöglicht eine hochauflösende Untersuchung der neuronalen Entwicklung und genetischer Störungen. Dieser Arbeitsablauf unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium und die mechanistische Risikominderung, indem er eine direkte Visualisierung der neuronalen Architektur sowie der phänotypischen Konsequenzen von Mutationen bietet. Die Methode ist strategisch günstig für die Selektion von Projektportfolios und zur Steigerung der Vorhersagesicherheit in neuroentwicklungsbiologischen Forschungspipelines positioniert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Beurteilung neuronaler Phänotypen als Reaktion auf genetische Modifikationen.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung neurodevelopmentaler Zielstrukturen durch antikörperbasierte Visualisierung.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem aberrante Muster des Nervensystems mit Einzelzellauflösung aufgedeckt werden.
- Bietet eine robuste Plattform für die hypothesengeleitete Untersuchung entwicklungsbiologischer Signalwege.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert ein reproduzierbares System zur quantitativen Visualisierung neuronaler Strukturen.
- Standardisiert die antikörperbasierte Detektion für die nachgeschaltete Untersuchung genetischer oder chemischer Störungen.
- Ermöglicht die skalierbare Aufbereitung von Embryonen für bildbasierte Hochdurchsatzanalysen.
- Liefert quantitative Ergebnisse, die für vergleichende Analysen über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Visualisierung neurodevelopmentaler Defekte und ist somit an krankheitsrelevanten Modellen ausgerichtet.
- Unterstützt die Kontinuität von der genetischen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in der Neurobiologie.
- Liefert phänotypische Endpunkte für die risikoadjustierte Weiterentwicklung neuroaktiver Substanzen.
- Steigert den Vorhersagewert bei der Identifizierung translationaler Biomarker in der Entwicklungsneurowissenschaft.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in die Entdeckungskette, die von der frühen genetischen Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur Validierung präklinischer Modelle in der neurodevelopmentalen Forschung reicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Nullhypothesenprüfung, indem sie die Visualisierung neuronaler Musteränderungen nach genetischer Manipulation ermöglicht.
- Screening: Bietet standardisierte, reproduzierbare Bildgebungsdaten für den vergleichenden Nachweis phänotypischer Effekte.
- Analytik: Liefert quantitative, antikörperbasierte Messgrößen für eine robuste statistische Analyse der neuronalen Entwicklung.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Phase, indem phänotypische Ergebnisse mit krankheitsrelevanten Endpunkten abgeglichen werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform für vielfältige Studien zur neurodevelopmentalen Forschung über verschiedene genetische Hintergründe hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung neurodevelopmentaler Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Arbeitsabläufe für die antikörperbasierte neuronale Visualisierung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Projektfortführung oder -einstellung und die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige phänotypische Klarheit geschaffen wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung neurodevelopmentaler Zielstrukturen und Wirkstoffe.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila und in der Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Benötigt Zugang zu Fluoreszenzbildgebungsausrüstung und validierten Antikörperreagenzien.
- Setzt eine strenge, standardisierte Abstimmung zwischen den Teams bei der Embryonalstadieneinteilung und den Färbeprotokollen voraus.
- Kann je nach genetischem Hintergrund oder Entwicklungsstadium Anpassungen erfordern.
- Sorgfältiger Umgang mit den Embryonen ist entscheidend, um Probenverluste zu vermeiden und die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
