Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila

Um die Rekonstruktionen sich entwickelnder Organe innerhalb der Drosophila melanogaster durchzuführen, müssen wir das Vorwärtsmodell bestimmen, das die Lichtausbreitung innerhalb der Puppe am besten beschreibt. Das Verfahren beginnt damit, eine weiße Vorpuppe auszuwählen und sie am Ende eines Kapillarrohrs so anzukleben, dass die anteriore-posteriore Achse der Puppe parallel zur Röhre ausgerichtet ist. Ein dünnes Kapillarrohr wird mit etwas fluoreszierendem Farbstoff gefüllt und in das Puppengehäuse eingeführt.

Nach sorgfältiger Achsenanpassung wird die Puppe um 360 Grad gedreht. Bilder werden aus verschiedenen Winkeln aufgenommen. Die gewonnenen fluoreszierenden Durchlichtdaten werden verwendet, um das Vorwärtsmodell zu bestimmen, das zur Abbildung der Organentwicklung eingesetzt wird.

Hallo, mein Name ist Claudia und ich befinde mich am Zentrum für Assistierte Biologie im Massachusetts General Hospital der Harvard Medical School. Ich bin Ula Petou aus dem Paramount-Labor der Harvard Medical School, und ich bin Daniel Rozanski vom Institut für Biologische und Medizinische Bildgebung an der Technischen Universität München und dem Helmholtz-Zentrum München. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur dreidimensionalen Rekonstruktion des gesamten Körpers in Oph Melano Casta.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor zur in vivo-Visualisierung der Entwicklung von Organen während des Pupillenstatus. Beginnen wir also. Bitte beachten Sie, dass es ein begleitendes Video gibt, das vor diesem angesehen werden sollte, in dem einige technische Aspekte der optischen Projektionstomographie detaillierter erläutert werden als hier.

Außerdem erläutert das andere Video die Bildgebung von präparierten Geweben oder Organen größerer Tiere. Für alle in diesem Video behandelten Experimente werden Drosophila-Transgene verwendet. Dabei handelt es sich um EL A gal vier, das in den Speicheldrüsen exprimiert wird, um Apteris gal vier, das in den larvalen Vorläufergeweben des adulten Flügels und des Thorax exprimiert wird, sowie um das Transgen, das ein fluoreszierendes Protein erzeugt.

Als Reaktion auf Gal vier, bezeichnet als U-A-S-G-F-P, und weiß 1118 werden die nicht fluoreszierenden Kontrollmännchen, die die UAS-Transgene tragen, mit jungfräulichen Weibchen gekreuzt, die die GAL-vier-Transgene tragen, um ein gewebespezifisches Expressionsmuster von G-F-P zu erzielen. Die Kreuzungen werden mit acht bis zehn jungfräulichen Weibchen und Männchen auf standardisiertem Fliegenmedium mit einer Prise Bäckerhefe angesetzt. Die Gefäße werden an der Oberfläche bei 25 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator unter einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Wechsel gehalten.

Zwei Tage nach der Durchführung der Kreuzung werden die Eltern in ein frisches Gefäß überführt, und fünf bis sechs Tage später beginnen die PUI, das Gefäß mit weißen PrepU zu besiedeln. Diese werden unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop anhand der GFP-Expression ausgewählt. Die Auswahl weißer PrepU gewährleistet eine korrekte Stadieneinteilung der Tiere, da sie etwa eine Stunde lang weiß bleiben.

Nach der Pupation färben sie sich dann und werden pigmentiert oder bräunlich. Die GFP-exprimierenden Puppen werden vorsichtig mit einem angefeuchteten Pinsel aus den Röhrchen gesammelt und in einen Tropfen Wasser oder PBS in einer Petrischale gegeben, müssen aber von autofluoreszierenden Materialien gereinigt werden. Mit dem Pinsel sollten sie nun bereit sein für die tomographische Bildgebung.

Wenn sich die PrepU weiter entwickeln müssen, um das korrekte Entwicklungsstadium zu erreichen, können sie in einer Petrischale mit einem feuchten Papiertuch oder in einer sauberen Futterflasche belassen werden. Dies gewährleistet eine ausreichende Luftfeuchtigkeit und eine ordnungsgemäße Entwicklung für die Bildgebung. Die PrepU müssen an der Innenseite eines Glas-Kapillarrohrs mit einem Durchmesser von 800 Mikron befestigt werden.

Bestreichen Sie das hintere Ende der Pupille mit Sekundenkleber und richten Sie die verklebte Fläche der Präpuppe in das Röhrchen so aus, dass die anteriore-posteriore Achse der Fliege parallel zum Röhrchen verläuft. Der vordere Teil des Tieres ragt nun über das Kapillarröhrchen hinaus. Das Kapillarröhrchen ist nun auf der Drehbühne des Mikroskops befestigt.

In vertikaler Position justieren Sie die Kippachse des Drehstages so, dass die Rotationsachse des Röhrchens parallel zu den Pixelspalten des abbildenden CCD-Sensors verläuft. Nachdem die Position der Fliege feinabgestimmt wurde, fahren Sie mit der Aufnahme fort. In diesem Beispiel sollen Tiere mit fluoreszierenden Speicheldrüsen abgebildet werden, sodass Exemplare, die GFP in ihren Speicheldrüsen exprimieren, aus einem Kreuzungsansatz zwischen EAG vier und U-A-S-G-F-P-Stämmen gewonnen werden können.

Wir beginnen mit einem montierten Präpupa, beleuchten das Präpupa mit einem Anregungsstrahl und erfassen das GFP-Fluoreszenzsignal. Bei der Durchlichtbeleuchtung wird das Präpupa um 360 Grad entlang seiner vertikalen Achse gedreht und die Durchlichtbilder aufgenommen. Jedes Bild entspricht einer Drehung um 10 Grad.

Die gesamte Aufnahmezeit hängt von der Menge der Fluoreszenz und von der Intensität des Anregungsstrahls ab. Typische Zeiten liegen in der Größenordnung einer Minute. In diesem Beispiel wird eine DSO-Puppe, die GFP in den Flügel-Imaginalanlagen exprimiert, abgebildet.

Diese Puppe kann aus einem Gefäß mit einer Kreuzung zwischen Aus GAL vier und U-A-S-G-F-P-Stämmen gewonnen werden. Die Präpuppe wird wie zuvor beschrieben präpariert. Da jedoch die Aufnahmezeit für dieses Experiment etwa acht Stunden beträgt, ist es entscheidend, dass die Umgebung feucht bleibt und Raumtemperatur aufweist, um eine Austrocknung und den Tod des Tieres zu vermeiden. Ein Verschluss wird über den Anregungsstrahl gebracht, um die Löschung von floral vier im betreffenden Gewebe zu verhindern sowie sicherzustellen, dass das Tier wie zuvor nicht durch den Laserstrahl verbrannt wird; beleuchten Sie mit dem Anregungsstrahl und sammeln Sie das GFP-Fluoreszenzsignal durch Durchlichtbeleuchtung.

Die Präpuppe wird vollständig um ihre vertikale Achse gedreht. Während der Datensammlung dauert die Drehung nur eine Minute und wird in unterschiedlichen zeitlichen Abständen wiederholt. Um eine Zeitrafferserie von Bildern der Flügel während der Entwicklung zu erstellen, können Daten mindestens sechs Stunden lang mit einer Rate von 100 Bildern pro Stunde aufgezeichnet werden.

Es ist entscheidend, dass die gesamte Lichtexposition mit diesem Verschluss gesteuert wird, um Schäden oder Photobleichen zu verhindern. Dieser Film zeigt Bilder, die zwischen dem PrepU-Stadium und der Pupillen-Aversion aufgenommen wurden. Bei der Rekonstruktion des dreidimensionalen Bildes tritt eine starke Vorwärtsstreuung auf, die berücksichtigt werden muss und nicht durch Diffusion angenähert werden kann.

Um die Rekonstruktion durchzuführen, muss ein Vorwärtsstreuungsmodell der Lichtausbreitung bestimmt werden. Der Einfachheit halber vernachlässigen wir die Absorption. Die Menge der Streuung wird experimentell überprüft. Dazu wird ein Fremdkörper mit standardisierter Fluoreszenz in die nichtfluoreszierende weiße 1118-Präpuppe eingebracht, die anschließend gescannt wird, um die Daten für das Vorwärtsmodell zu generieren. Beginnen Sie damit, ein 100-Mikrometer-Silikakapillarrohr mit PS 5.5-Fluoreszenzfarbstoff zu füllen.

Unter Verwendung der Kapillarwirkung wird die Kapillare unter einem Winkel von 45 Grad zur vorderen Achse in die Puppe eingeführt; montieren Sie das PrepU in einer Kapillare und positionieren Sie es wie zuvor beschrieben geeignet auf der rotierenden Probehalterung. Belichten Sie nun die Vorpuppe mit einem Anregungslaserstrahl unter Verwendung einer Linse mit geringer numerischer Apertur und nehmen Sie fluoreszierende Durchlichtbilder der Vorpuppe auf. Wie bereits beschrieben, wird die MATLAB-Software verwendet, um die Daten in das explizite theoretische Vorwärtsmodell anzupassen. Zur Erleichterung des Rekonstruktionsprozesses wird die feste e-Approximation der Transportgleichung gewählt, da sie den Vorwärtsstreuungsbereich beschreibt und ebenfalls gut zu den experimentellen Daten passt.

Nachdem das korrekte Vorwärtsmodell bestimmt wurde, können die Speicheldrüsen rekonstruiert und die zeitraffenden tomographischen Rekonstruktionen erhalten werden. Falls eine Tomographie im Freiraum verwendet werden soll, können ebenfalls Konfigurationsalgorithmen zur Brechungsindex-Anpassung eingerichtet werden. Zunächst zeigen wir eine 3D-Rekonstruktion der Speicheldrüsen zu einem frühen Entwicklungszeitpunkt.

Zum Vergleich zeigt die histologische Färbung der Speicheldrüsen, dass die Rekonstruktionen gut mit der Histologie übereinstimmen. Dieser Zeitrafferfilm zur Entwicklung der imaginalen Flügelscheiben wurde an einem einzelnen lebenden Exemplar aufgenommen. Zur Gegenüberstellung zeigt die histologische Färbung der Flügelscheibe zu denselben Zeitpunkten, dass die Rekonstruktionen gut mit der Histologie korrelieren.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man ein System zur Abbildung dreidimensionaler Strukturen innerhalb von oph in vivo und über die Zeit aufbaut. Dies ermöglicht es uns, die Morphogenese in Drosophila sowie die Entwicklung der Flügel über sechs aufeinanderfolgende Stunden zu verfolgen. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es entscheidend, das korrekte Vorwärtsmodell für die Lichtausbreitung innerhalb von Drosophila zu wählen.

Diese Methode kann in Kombination mit histologischen Techniken verwendet werden, um Einblicke in die Organentwicklung während der Oph-Pupillen-Stadien zu gewinnen, und sie kann für die Untersuchung verschiedener Organismen ähnlicher Größe modifiziert werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.