Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Bei dieser Technik werden Glasdeckgläser mit einer Mischung aus inerten und Biotin-PEG-Molekülen funktionalisiert. Mit dieser funktionalisierten Oberfläche wird eine Durchflusszelle hergestellt und auf ein TIRF-Mikroskop platziert. Biotinylierte Rolling-Circle-Vorlagen werden mithilfe multivalenter Streptavidin an der Oberfläche fixiert.

Wenn die Substrate durch Zugabe von Replikationszonen-Proteinen und Nukleotiden repliziert werden, wird die entstehende doppelsträngige DNA durch laminare Strömung verlängert und in Echtzeit mithilfe eines interkalierenden Farbstoffs abgebildet. Hallo, ich bin Nathan Tanner aus dem Labor von Antoine Van Ians am Department für Biochemie und Molekularpharmakologie der Harvard Medical School. Ich bin Joe Laro, ebenfalls aus dem Van Noian-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Fluoreszenz-Bildgebung der DNA-Replikation in Echtzeit auf einzelnen Molekülen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um koordinierte DNA-Syntheseaktivitäten einzelner Replikationskomplexe zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um dieses Verfahren zu beginnen, annealen Sie das biotinylierte Tail-Oligo an die M13-Einzelstrang-DNA, indem Sie ein zehnfaches Überschuss an Oligo in TBS-Puffer hinzufügen, auf 65 Grad Celsius erhitzen und dann den Wärmeblock ausschalten, um eine langsame Abkühlung zu ermöglichen, die eine korrekte Annealing des Primers gewährleistet. Nachdem der Primer M13 vorbereitet ist, geben Sie ihn zu einer Mischung aus 64 Nanomolar T7-DNA-Polymerase und T7-Replikationspuffer, die dNTPs und Magnesiumchlorid enthält, und inkubieren die Reaktion 12 Minuten bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie die Inkubation durch Zugabe von 100 Millimolar EDTA.

Reinigen Sie anschließend das aufgefüllte Produkt-DNA mittels Phenol-Isoamylalkohol-Chloroform-Extraktion und dialysieren Sie es in TE-Puffer oder einen anderen geeigneten Lagerpuffer. Extrahieren Sie jede organische Phase erneut, um eventuell verbliebene primerte M13-DNA zurückzugewinnen. Bestimmen Sie nach der Dialyse die DNA-Konzentration mit einem UV-Vis-Spektrophotometer. Eine Runde der Template-Präparation kann ausreichend Nanomolar-Konzentration an Template für Hunderte bis Tausende Einzelmolekül-Experimente liefern.

Nun, da die DNA vorbereitet ist, fahren Sie mit der Herstellung der funktionalisierten Deckgläser fort. Die zu replizierende DNA wird an mit Amil Lane funktionalisierte Glasdeckgläser gebunden, wobei die Oxygruppe des Amil an das Glas bindet und eine Aminogruppe freisetzt, die zur Bindung biotinylierter PEG-Moleküle dient. Diese Beschichtung trägt dazu bei, unspezifische Bindungen an der Oberfläche zu verringern.

Um die Glasdeckgläser gründlich zu reinigen, legen Sie sie in Färbegefäße und füllen die Gefäße mit Ethanol, das 30 Minuten lang ultraschallbehandelt wird. Spülen Sie die Gefäße aus und füllen Sie sie mit einmolarer Kaliumhydroxidlösung; behandeln Sie diese 30 Minuten lang mit Ultraschall und wiederholen Sie beide Waschschritte. Für die erste Funktionalisierungsreaktion müssen alle Spuren von Wasser entfernt werden.

Füllen Sie die Färbegefäße mit Aceton und behandeln Sie sie 10 Minuten lang mit Ultraschall. Leeren Sie die Gefäße und füllen Sie sie erneut mit Aceton. Geben Sie anschließend das Sine-Reagenz zu den Gefäßen hinzu und schütteln Sie zwei Minuten lang.

Anschießend mit einem großen Überschuss an Wasser abspülen. Danach die Deckgläser trocknen, indem sie 30 Minuten lang bei 110 Grad Celsius im Ofen gebacken werden. Als Nächstes die PEG-Mischung mit etwa 0,2 % Gewicht pro Volumen herstellen, wobei ein Glas-Deckglas-Abstandshalter verwendet wird, um die Deckgläser voneinander zu trennen; pipettieren Sie 100 Mikroliter auf ein trockenes silanisiertes Deckglas.

Legen Sie eine zweite Deckglas auf die erste. Inkubieren Sie die Deckgläser drei Stunden lang in der PEG-Lösung. Trennen Sie anschließend jedes Paar Deckgläser und waschen Sie sie gründlich mit Wasser.

Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser mit der funktionalisierten Seite nach oben liegen, da nur eine Seite mit PEG beschichtet ist. Trocknen Sie die Deckgläser abschließend mit Druckluft und lagern Sie sie unter Vakuum in einem Exsikkator; die Oberflächen bleiben mindestens einen Monat stabil. Auf diese Weise können Dutzende von Deckgläsern in einer Charge hergestellt und nach Bedarf verwendet werden.

Da die Deckgläser nun bereit sind, kann man die Flusskammer für das Einzelmolekül-Experiment zusammenbauen. Geben Sie zunächst 20 bis 25 Milliliter Blockpuffer mit BSA in ein Exsikkator, um Luftblasen für spätere Schritte zu entfernen. Verdünnen Sie anschließend 25 Mikroliter Streptavidin in 100 Mikroliter PBS und verteilen Sie die Lösung auf der Oberfläche eines mit Peg funktionalisierten Deckgläschens. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bindung von Streptavidin an die biotinylierte Oberfläche zu ermöglichen, während andere Teile der Kammer vorbereitet werden.

Während der Deckglaser im Brutschrank inkubiert wird, schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband mit Trägerfolie auf beiden Seiten zurecht, sodass es der Größe des Quarzobjektträgers entspricht, der zur Montage der Durchflusskammer verwendet wird. Markieren Sie die Position der Schlauchbohrungen auf dem Klebeband mit einem Bleistift, damit ein Umriss der Durchflusskammer auf das Band gezeichnet werden kann. Nachdem die Bohrungen markiert wurden, zeichnen Sie ein zwei Millimeter breites Rechteck um die Markierungen herum.

Dieses Rechteck dient als Durchflusskanal. Achten Sie daher darauf, gerade Seiten zu schneiden und genügend Platz um den Schlauchzulauf und -ablauf freizulassen. Schneiden Sie nun das markierte Klebeband entlang der eingezeichneten Kontur, und führen Sie gerade, saubere Schnitte aus, um sicherzustellen, dass kein Klebstoff in den Kanal hineinragt. Reinigen Sie den Quarzobjektträger gründlich mit Aceton, um Klebstoffrückstände von Durchflusszellen zu entfernen, die in vorherigen Experimenten verwendet wurden.

Finden Sie die optimale Ausrichtung der Kanalumrisslinie. Entfernen Sie eine Seite der Klebefolie und platzieren Sie das Band vorsichtig auf dem Objektträger. Achten Sie darauf, das Band korrekt auszurichten, da die Einlass- und Auslassöffnungen frei bleiben müssen.

Bereiten Sie als Nächstes die Schläuche in einer Länge von 0,76 Millimeter für den Einlass und Auslass der Durchflusszelle vor. Es ist hilfreich, das Ende des Schlauchs in einem Winkel von etwa 30 Grad abzuschneiden, damit der Schlauch nicht flach auf dem Boden der Kammer aufliegt. Stellen Sie die Schläuche auf Reagenzglasgestelle, um sie in den nächsten Schritten leicht an die Durchflusszelle anschließen zu können.

Mittlerweile ist die Inkubation der Deckgläser beendet. Spülen Sie das mit Strep-Avidin-ENC beschichtete Deckglas gründlich mit Wasser ab und trocknen Sie es mit Druckluft. Achten Sie darauf, das Deckglas nicht umzudrehen, da nur eine Seite funktionalisiert ist.

Schließen Sie schließlich die Montage der Flusskammer ab, indem Sie die andere Seite der Klebebandabdeckung entfernen und den Quarzobjektträger auf die Deckglasplatte legen. Drücken Sie leicht auf das Deckglas, um eingeschlossene Luft aus dem Klebstoff zu verdrängen. Dies trägt dazu bei, die Bildung von Luftblasen im Flusskanal zu verhindern.

Versiegeln Sie die Seiten der Kammer mit Epoxidharz. Führen Sie den zugeschnittenen Schlauch in die Bohrungen des Quarzes ein und verschließen Sie ihn mit Epoxidharz. Lassen Sie das Ganze einige Minuten trocknen. Sobald die Epoxidsiegelung trocken ist, beginnen Sie mit der Blockierung der Oberfläche.

Unter Verwendung einer 21-Gauge-Nadel ziehen Sie etwas des Degas-Blockierpuffers durch eines der Röhrchen. Spülen Sie mehrmals durch, um Luftblasen zu entfernen, und lassen Sie die Kammer mindestens eine halbe Stunde inkubieren, bevor Sie mit dem Einzelmolekül-Replikations-Experiment fortfahren.

Nachdem die Flusszelle blockiert wurde, platzieren Sie sie auf dem Mikroskopstadium. Halten Sie die Kammer mit Bühnenklammern fest und stellen Sie sicher, dass der Flusskanal entlang der y-Achse ausgerichtet ist. Verbinden Sie das Auslassrohr der Flusszelle mit der Spritzenpumpe, indem Sie einen Schlauch mit größerem Durchmesser als Verbindungsstück verwenden.

Platzieren Sie den Inlet in Blockpuffer und ziehen Sie mit der Spritze zurück, um Luft aus dem Schlauch zu entfernen. Ein sanftes Klopfen auf den Outlet-Schlauch hilft dabei, Luftblasen, die in der Flusszelle eingeschlossen sind, zu entfernen. Geben Sie nun die DNA hinzu, verdünnen Sie die DNA-Ausgangslösung auf 25 Pikomolar in einem Milliliter Blockpuffer und lassen Sie diesen 30 Minuten lang mit moderater Flussrate, beispielsweise 0,025 Milliliter pro Minute, in die Kammer fließen, um eine gute Oberflächenbedeckung mit DNA zu gewährleisten.

Sobald sich die DNA in der Kammer befindet, spülen Sie überschüssige DNA mit Blockierpuffer mindestens 200 Flusszellen-Volumina lang aus. Um die gesamte freie DNA zu entfernen, schalten Sie den Laser und die Kamera ein. Die gekühlte CCD-Kamera muss die Betriebstemperatur erreichen, bevor sie verwendet werden kann.

Nachdem überschüssige DNA abgewaschen und der Replikationspuffer entgast wurde, bereiten Sie die Replikationsreaktionsmischung mit Nukleotiden, DTT und Cytoxin im Replikationspuffer vor. Anschließend geben Sie die Proteine hinzu und mischen vorsichtig. Danach leiten Sie die Reaktionsmischung in die Flusszelle ein.

Die Strömungsgeschwindigkeit muss hier ausreichend sein, um doppelsträngige DNA in einem zwei Millimeter breiten und 100 Mikrometer hohen Strömungskanal zu strecken. Eine Durchflussrate von 0,04 Milliliter pro Minute hat sich bewährt. Geben Sie der Mischung etwa 10 Minuten Zeit, um in die Kammer einzutreten.

Bewegen Sie das Sichtfeld zur Seite des Kanals und fokussieren Sie auf das Klebematerial, um sicherzustellen, dass man sich nahe der Oberfläche befindet, um zu fokussieren und mit der Bildaufnahme zu beginnen. Passen Sie die Laserleistung, den Mikroskopfokus und den Turf-Winkel an. Halten Sie die Leistung niedrig, um eine photochemische Spaltung der gefärbten DNA zu vermeiden.

Je nach Geschwindigkeit der DNA-Replikation eine bis fünf Bilder pro Sekunde über mehrere Minuten aufnehmen. Wiederholen Sie den Vorgang, um längere Replikationsverläufe zu erhalten, oder wechseln Sie zu einem neuen Bildausschnitt, um weitere Moleküle zu beobachten, wenn nahezu die gesamte Reaktionsmischung in die Zellströmung gepumpt wurde; geben Sie mehr Puffer mit Cyt zu, um andere Sichtfelder zu betrachten. Die Aufnahme mehrerer Bilder verschiedener replizierter Moleküle liefert statistische Daten zur Bestimmung der Produktivität.

Bei der Rolling-Circle-Replikation verlängert die führende Strangsynthese das Ende, das den Kreis mit der Oberfläche verbindet, und das Ende wird durch die Polymerase des nachfolgenden Strangs in doppelsträngige DNA umgewandelt und durch die gezeigte laminare Strömung gestreckt. Hier ist ein Beispiel für ein Sichtfeld mit Cyt Orange bei 532 Nanometer Anregung.

Die kleinen fluoreszierenden Flecken sind verankerte, nicht replizierte Substrate. Beachten Sie die extreme Länge der Produkte und die große Anzahl an Produkten pro Feld. Ein typisches Sichtfeld zeigt zahlreiche replizierende Moleküle, die als helle, wachsende Linien aus gefärbter DNA sichtbar sind. E. Coli-Experimente bei 37 Grad Celsius ergeben je nach Oberflächendichte fünf bis 50 Moleküle pro Feld.

Die T7-Replikationszone setzt viel effizienter ein und wird mehr als 50 % der Moleküle in einem Feld replizieren. Aufgrund dieser hohen Dichte ist es schwierig, einzelne Moleküle wie hier gezeigt aufzulösen. Führen Sie daher das T7-Experiment bei niedrigeren Protein-Konzentrationen oder geringerer Oberflächendichte durch. Chimäre Graphen typischer replizierender Moleküle aus E. coli- und T7-Experimenten enthalten Endpunkt-Trajektorien von Molekülen aus E. coli und T7, die über die Zeit aufgetragen sind. Die Trajektorien werden mittels linearer Regression angepasst, um die Replikationsraten zu ermitteln, die in diesem Beispiel 467,1 Basenpaare pro Sekunde für E. coli und 99,4 Basenpaare pro Sekunde für T7 betragen.

Für T7 ergeben die Ratenverteilungen einzelner Molekültrajektorien, die mit einzelnen Gauß-Funktionen angepasst wurden, eine mittlere Geschwindigkeit von 535,5 ± 39 Basenpaaren pro Sekunde für E. coli und 75,9 ± 4,8 Basenpaaren pro Sekunde für G7. Für T7 werden die Längenverteilungen der Replikationsprodukte mit einem einfachen exponentiellen Abfall angepasst, um die Produktivität zu erhalten, die bei 85,3 ± 6,1 Kilobasenpaaren für E. coli und 25,3 ± 1,7 Kilobasenpaaren für G7 liegt. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man koordinierte DNA-Replikation auf Einzelmolekülebene messen kann.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Deckgläser ordnungsgemäß zu funktionalisieren und saubere, gerade Flusskanäle anzulegen. Achten Sie darauf, die Laserleistung niedrig zu halten und die photochemische Spaltung der langen DNA zu minimieren. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.