Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Visualisierung der DNA-Replikation mittels Weitfeld-Optikmikroskopie an linearisierter und chemisch modifizierter Lambda-DNA. Die DNA wird an eine funktionalisierte Glasdeckenscheibe gebunden. Das freie Ende der DNA ist mit einer markierten Kugel versehen und die DNA wird durch laminare Strömung gestreckt.

Wenn die Replikation initiiert wird, beginnt der Leitstrang länger zu werden und der Folgestrang verkürzt sich aufgrund der Aufwicklung. Der große Unterschied in der Länge zwischen doppelsträngiger und einfachsträngiger DNA bei niedrigen Kräften ermöglicht eine direkte Beobachtung der DNA-Umwandlungen während der Replikation. Die Länge des DNA-Konstrukts wird durch die Verfolgung der Position der Perle überwacht, was eine präzise Bestimmung von Geschwindigkeit und Ablauf der DNA-Replikation erlaubt.

Hallo, ich bin Ari Ulrich aus den Laboren von Anto van der Vanian und Charles Richardson an der Abteilung für Biologische Chemie und Molekulare Pharmakologie der Harvard Medical School. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Abbildung der DNA-Replikation auf einzelner Molekülebene. In unseren Laboren verwenden wir dieses Verfahren, um enzymatische Aktivitäten zu untersuchen, die während der DNA-Synthese stattfinden.

Beginnen wir also. Zu Beginn dieses Verfahrens wird linearisierte bakterielle Phagen-Lambda-DNA durch eine annealing-oligonukleotide modifiziert, um eine Replikationsgabel, einen lambda-komplementären Gabelarm, einen biotinylierten Gabelarm und einen Gabelprimer zu bilden. Der biotinylierte Gabelarm enthält ein an seinem 5'-Ende angeheftetes Biotin, das die Verankerung der DNA-Vorlage an der Oberfläche der Durchflusszelle ermöglicht.

Die Lambda-DNA wird weiter modifiziert, indem ein weiteres Oligonukleotid, das eine Diggen- und eine Moiety-Gruppe enthält, das als Immuno-Tag mit hoher Affinität für die Anheftung einer Perle dient, angeheuert wird. Um die Replikationsgabel zu erzeugen, beschaffen Sie Lambda-DNA sowie mehrere Oligonukleotide, deren Sequenzen im schriftlichen Protokoll ergänzend zu diesem Video zu finden sind. Zu diesen Oligonukleotiden gehören ein biotinyliertes Gabel-Arm, ein lambda-komplementäres Gabel-Arm, ein Gabel-Primer sowie ein lambda-komplementäres Diggen und Ende, das die fünf-Prime-Enden des lambda-komplementären Gabel-Arms und des lambda-komplementären Digo-Genin-Endes mittels T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert.

Mischen Sie als Nächstes den phosphorylierten komplementären Lambda-Fork-Arm, den biotinylierten Fork-Arm, den Fork-Primer und die Lambda-DNA im molaren Verhältnis von 10 zu 10 zu 100 zu 1. Erhitzen Sie das Gemisch im T4-DNA-Ligase-Puffer auf 65 Grad Celsius für fünf Minuten und kühlen Sie es langsam auf Raumtemperatur ab, indem Sie das Wärmeblock ausschalten, um eine ordnungsgemäße Annealing der Oligonukleotide und der T4-DNA-Ligase an das Gemisch zu ermöglichen, und inkubieren Sie es für zwei Stunden. Bei Raumtemperatur katalysiert die T4-DNA-Ligase das Verschließen der Nickstellen zwischen den Oligonukleotiden und dem Lambda.

Die DNA wird schließlich mit dem komplementären Lambda-Diggen-Ende an die DNA-Replikationsschablone ligiert, indem das phosphorylierte, komplementäre Lambda-Diggen-Ende in T4-Ligase-Puffer gegeben und die Mischung 30 Minuten bei 45 Grad Celsius inkubiert wird. Anschließend wird langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, indem der Wärmeblock ausgeschaltet wird. Die Ligierung des phosphorylierten, komplementären Lambda-Diggen-Endes an die DNA-Replikationsschablone erfolgt durch Zugabe von T4-DNA-Ligase zur Mischung und zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur. Die fertige DNA-Replikationsschablone ist nun gebrauchsfertig. Um die aktivierten magnetischen Perlen an die DNA-Replikationsschablone zu binden, müssen diese mit einem FAB-Fragment, das spezifisch für Digoxigenin ist, funktionalisiert werden.

Um diesen Prozess zu beginnen, resuspendieren Sie die Stammlösung der Kügelchen und überführen 400 Mikroliter in ein Eppendorf-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen in einen Magnetenabscheider und inkubieren Sie, bis die Lösung klar wird. Anschließend entfernen Sie den Überstand mittels Pipettieren. Um die Amino-Gruppen für die Antikörperkupplung zu aktivieren, geben Sie einen Milliliter Aktivierungspuffer hinzu und mischen vorsichtig durch Pipettieren.

Entfernen Sie erneut den Überstand mithilfe eines magnetischen Separators. Geben Sie anschließend 240 Mikroliter FAB-Fragment hinzu und resuspendieren Sie die Perlen in 400 Mikrolitern Boratpuffer. Gründlich mischen und 16 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator inkubieren lassen.

Nach der Inkubation die Beads mithilfe des Magnetenabscheiders trennen und den Überstand entfernen. Die Beads mit einem Milliliter Waschpuffer waschen und fünf Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, anschließend den Puffer mithilfe des Magnetenabscheiders entfernen. Dieser Waschschritt wird zweimal wiederholt.

Um die freien Tosylgruppen zu blockieren, ein Milliliter BSA in Tris-Puffer zugeben und vier Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation den Puffer mithilfe eines magnetischen Separators von den Kügelchen entfernen, zweimal mit Puffer waschen und aliquotieren. Zum Gebrauch wird die zu replizierende DNA an Glasdecken festgemacht, die mit Amil-Lane funktionalisiert sind.

Die Oxy-Gruppe der Amil-Lane bindet an das Glas, wodurch ein Amin zur Bindung an biotinylierte PEG-Moleküle frei bleibt. Diese Beschichtung trägt dazu bei, unspezifische Bindungen an der Oberfläche zu verringern. Um die Glasdeckchen gründlich zu reinigen, legen Sie sie in Färbegefäße und füllen Sie die Gefäße mit Ethanol, anschließend Ultraschallbehandlung durchführen.

Spülen Sie die Gläser 30 Minuten lang aus und füllen Sie sie mit einmolarer Kaliumhydroxid-Lösung, die 30 Minuten lang ultraschallbehandelt wird; wiederholen Sie beide Waschschritte. Für die erste Funktionalisierungsreaktion müssen alle Spuren von Wasser entfernt werden. Füllen Sie die Färbegefäße mit Aceton und behandeln Sie sie 10 Minuten lang mit Ultraschall.

Leeren Sie die Gläser und füllen Sie sie erneut mit Aceton. Geben Sie anschließend das Sine-Reagenz zu den Gläsern hinzu und schütteln Sie zwei Minuten lang. Danach mit einem großen Überschuss an Wasser abbrechen.

Anschließend trocknen Sie die Deckgläser, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 110 Grad Celsius im Ofen backen. Danach bereiten Sie die PEG-Mischung mit etwa 0,2 % Gewicht pro Volumen vor. Biotinyliertes PEG, zusammen mit einem Abstandshalter aus Glasdeckglas, ermöglicht die Trennung der Deckgläser; pipettieren Sie 100 Mikroliter auf ein trockenes silanisiertes Deckglas.

Legen Sie einen zweiten Deckel auf. Inkubieren Sie die Deckel in der PEG-Lösung für drei Stunden. Trennen Sie dann jedes Paar Deckel und waschen Sie sie ausgiebig mit Wasser.

Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser mit der funktionalisierten Seite nach oben liegen, da nur eine Seite mit PEG beschichtet ist. Trocknen Sie die Deckgläser abschließend mit Druckluft und lagern Sie sie unter Vakuum in einem Exsikkator. Die Oberflächen bleiben mindestens einen Monat stabil. So können Dutzende Deckgläser in einer Charge hergestellt und nach Bedarf verwendet werden.

Nachdem die Deckgläser vorbereitet sind, kann man die Durchflusskammer für das Einzelmolekül-Experiment zusammenbauen. Das Einzelmolekül-Experiment wird mit einer einfachen Durchflusskammer durchgeführt, die aus einem funktionalisierten Deckglas, doppelseitigem Klebeband, einem Quarzobjektträger und Schläuchen besteht. Für jedes Einzelmolekül-Experiment wird eine Durchflusskammer hergestellt.

Mischen Sie zunächst fünf Milliliter Blockierpuffer mit 20 Millilitern Arbeitspuffer und geben Sie die Mischung in ein Exsikkator, um Luftblasen für spätere Schritte zu entfernen. Anschließend werden 100 Mikroliter einer Arbeitslösung von strp din in PBS gleichmäßig auf der Oberfläche des peg-funktionalsierten Deckgläschens verteilt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bindung von strp din an Oberflächenbiotin zu ermöglichen. In der Zwischenzeit schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf die Größe des Quarzobjektträgers zu und markieren die Positionen der Schlauchbohrungen auf dem Band.

Umreißen Sie die Durchflusskammer, indem Sie einen drei Millimeter breiten Mittelkanal und Rechtecke, die beide Löcher enthalten, zeichnen. Durchflusskammern können mit zwei Y-förmigen Zulauf- und zwei Ablaufkanälen konstruiert werden. Schneiden Sie nun das markierte Klebeband entlang der gezeichneten Kontur aus und führen Sie gerade, saubere Schnitte durch, um sicherzustellen, dass kein Klebstoff in den Kanal hineinragt.

Reinigen Sie den Quarzobjektträger gründlich mit Aceton, um Klebstoffreste von der Strömungszelle, die in vorherigen Experimenten verwendet wurde, zu entfernen. Finden Sie die optimale Ausrichtung der Kanalumrisse. Entfernen Sie eine Seite der Klebfolie und platzieren Sie das Klebeband vorsichtig auf dem Objektträger.

Achten Sie darauf, das Klebeband korrekt auszurichten, da die Einlass- und Auslassöffnungen frei bleiben müssen. Bereiten Sie als Nächstes die Schläuche mit einer Länge von 0,76 mm Innendurchmesser für den Einlass und Auslass der Durchflusszelle vor. Schneiden Sie das Ende des Schlauchs in einem Winkel von etwa 30 Grad ab, damit der Schlauch nicht flach auf dem Boden der Kammer aufliegt.

Befestigen Sie den Schlauch an Reagenzglasgestellen, um im nächsten Schritt eine einfache Anbringung an der Durchflusszelle zu ermöglichen. Inzwischen sollte die Inkubation der Deckgläser abgeschlossen sein. Spülen Sie das Deckglas gründlich mit Wasser ab und trocknen Sie es mit Druckluft.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Deckglasplatte nicht umdrehen, da nur eine Seite mit PEG funktionalisiert ist. Vervollständigen Sie den Aufbau der Durchflusskammer, indem Sie die andere Seite der Klebefolie entfernen und den Quarzobjektträger auf das Deckglas legen. Drücken Sie leicht auf das Deckglas, um eingeschlossene Luft aus dem Klebstoff zu verdrängen. Dies hilft, Luftblasen im Durchflusskanal zu vermeiden.

Versiegeln Sie die Seiten der Kammer mit Epoxidharz. Führen Sie den abgeschnittenen Schlauch in die Löcher des Quarzes ein und verschließen Sie ihn mit Epoxidharz. Einige Minuten trocknen lassen.

Nach dem Trocknen etwas des DGAs-Blockpuffers mit einer 21-Gauge-Nadel durch eines der Röhrchen ziehen, um die Kammeroberfläche zu blockieren. Mehrmals spülen, um Luftblasen zu entfernen, und die Kammer mindestens 30 Minuten inkubieren lassen, bevor mit dem Einzelmolekül-Replikationsexperiment fortgefahren wird. Sobald die DNA-Vorlage-funktionalisierten Kügelchen und die Durchflusskammer vorbereitet sind, kann ein Einzelmolekül-Experiment durchgeführt werden.

Platzieren Sie zunächst die Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch. Halten Sie die Kammer mit Bühnenklammern fest und stellen Sie sicher, dass der Durchflusskanal mit der CCD-Kamera ausgerichtet ist. Schließen Sie die zuvor konstruierte Luftsprungscheibe an die Spritzenpumpe und an die Auslassschläuche der Durchflusszelle an.

Verwenden Sie Verbinderschläuche mit größerem Durchmesser, stellen Sie die Einlassschläuche der Durchflusszelle in Blockierpuffer und ziehen Sie vorsichtig am Spritzenkolben, um Luftblasen aus den Schläuchen zu entfernen. Klopfen Sie leicht auf die Auslassschläuche, um eventuell in der Durchflusszelle eingeschlossene Luftblasen zu entfernen. Sobald alle Luftblasen entfernt sind, verschließen Sie einen der Einlassschläuche mit einer Nadel und dichten Sie einen der Auslassschläuche ab, indem Sie ihn um 180 Grad verbiegen und mit Klebeband fixieren. Vor dem Hinzufügen der DNA zur Zelle verdünnen Sie die DNA-Standardlösung auf 10 Pikomolar in einem Milliliter DGAs one x Blockierpuffer. Leiten Sie die Vorlage mit moderater Flussrate in die Kammer ein, um eine gute Oberflächenbedeckung der DNA zu gewährleisten.

Verdünnen Sie die Stammlösung der Perlen auf zwei bis vier Mal 10 hoch sechs Perlen pro Milliliter. Geben Sie in ein Milliliter DGAs einen x Blockierpuffer. Anschließend wirbeln Sie das Gemisch und sonizieren es 20 Sekunden lang.

Leiten Sie die verdünnte Kügelchenlösung in die Kammer. Sobald die Kügelchen zugegeben sind, stoppen Sie den Durchfluss und lassen Sie die Kammer ein Gleichgewicht erreichen. Schließen Sie dann beide Auslassschläuche.

Jede Änderung an den Röhrchen, während die Kammer nicht geschlossen ist, verursacht Druckänderungen, die eine starke Kraft auf die Kügelchen ausüben und die gebundenen DNA-Moleküle abscheren. Verschließen Sie das Einlassröhrchen, das zum Beladen der Kügelchen verwendet wurde, mit einer Nadel unter Verwendung des zweiten Einlassröhrchens. Beginnen Sie damit, die Durchflusszelle gründlich mit DGAs einer x-Lösung Puffer zum Blockieren zu waschen.

Bewegen Sie den Objektträger durch vorsichtiges Antippen, um sicherzustellen, dass keine unspezifisch an der Oberfläche haftenden Perlen vorhanden sind. Die Perlen sind an die DNA gebunden. Versuchen Sie, die Strömungsrichtung zu wechseln.

Nachdem freie Kügelchen ausreichend entfernt wurden, schalten Sie den Durchfluss aus und lassen Sie die Kammer ein Gleichgewicht erreichen. Bereiten Sie eine frische Reaktionsmischung vor, die die im Textprotokoll angegebenen Replikationsproteine enthält. Schließen Sie das offene Auslassrohr und wechseln Sie das Zulaufreservoir auf die frisch zubereitete Reaktionsmischung.

Langsam das Ventil öffnen, um schnelle Druckänderungen zu vermeiden, die die enzymatische Reaktion beeinträchtigen könnten. Zunächst die Proteiniösung mit moderater Flussrate in die Kammer leiten, um eine effiziente Bindung an die DNA zu ermöglichen. Den Fluss abschalten und die Kammer ausgleichen lassen.

Schließen Sie die Auslassschläuche und ersetzen Sie den Schlauch, der das Reaktionsgemisch enthält. Spülen Sie mit dem Schlauch, der den DGA-Waschpuffer enthält, die Kammer, um freie Proteine nach dem Waschen zu entfernen. Schalten Sie erneut den Durchfluss aus und lassen Sie die Kammer das Gleichgewicht erreichen.

Schließen Sie die Auslassschläuche und ersetzen Sie den Schlauch, der den Waschpuffer enthält. Verwenden Sie anstelle dessen den Schlauch mit dem T7-Replikationspuffer, da der T7-Replikationspuffer Magnesiumchlorid enthält, das den Beginn der Replikationsreaktion auslöst. Wenden Sie eine Flussrate von 0,012 Millilitern pro Minute an, was einer Kraft von drei Piko-Newton entspricht, die unter den in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen auf die DNA-Anker wirkt.

Platzieren Sie einen Dauermagneten aus Seltenen Erden oberhalb der Durchflusszelle, bevor Sie die Aufnahme durchführen, um unspezifische Wechselwirkungen zwischen den Kügelchen und der Oberfläche zu verhindern. Positionieren Sie einen Faser-Beleuchter in einem Einfallswinkel zwischen 10 Grad und parallel zum Mikroskoptisch in der Nähe des mikroskopischen Sichtfelds mit einem 10×-Objektiv und einer CCD-Kamera. Dunkelfeldbeleuchtung wird verwendet, um den Kontrast bei der Fokussierung der Kügelchenaufnahme unter Verwendung eines verankerten Kügelchens zu erhöhen.

Beginnen Sie die Datenaufnahme für 20 bis 30 Minuten mit einer niedrigen Bildrate. In einem erfolgreichen Experiment können 100 Kügelchen gleichzeitig beobachtet werden. Das Experiment sollte zahlreiche Spuren zeigen, die die Synthese des vorangehenden DNA-Strangs darstellen.

Um die Geschwindigkeiten und Prozessivität der DNA-Aufspaltung und -Polymerisation zu messen, müssen die genauen Positionen der Perlen bestimmt werden. Fitten Sie diese Positionen mit zweidimensionalen Gauß-Funktionen. Visualisieren Sie die Trajektorie, indem Sie die Position der Perlen in jedem Einzelbild mithilfe einer Verfolgungssoftware verfolgen.

Tragen Sie anschließend die Position der Perle als Funktion der Zeit mit einer beliebigen Grafik-Software auf, um Ratenwerte zu erhalten. Passen Sie die Diagramme mit einer linearen Regression an und berechnen Sie die Steigung für den prozessiven Verlauf. Bestimmen Sie die Gesamtlänge der DNA vom Anfang bis zum Ende eines Verkürzungsereignisses.

Kombinieren Sie alle Einzelmessungen und stellen Sie die Verteilungen der Rate und Produktivität dar, indem Sie die Daten jeweils mit einer Gauß- und einer einfachen exponentiellen Funktion anpassen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Raten und Prozessivität der DNA-Replikation auf einzelnen Molekülen messen kann. Bei dieser Methode ist es wichtig sicherzustellen, dass die Kraft und die Scherkräfte durch den laminaren Fluss die enzymatischen Aktivitäten der Replikationsproteine nicht beeinträchtigen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Spaß bei Ihren Experimenten.