Aorten-Ring-Test

Das übergeordnete Ziel des Aortaringassays besteht darin, ein flexibles experimentelles System bereitzustellen, bei dem Blutgefäße aus ganzen Stücken der Mausaorta innerhalb einer 3D-Matrix hervorsprossen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Aorta thoracica einer Maus präpariert und anschließend sorgfältig von allen restlichen umgebenden Geweben befreit wird. Scheiben der gereinigten Aorta bzw. Aortaringe werden in einzelne Vertiefungen einer 48-Loch-Platte gegeben, wobei jede Vertiefung basalen Matrix-Extrakt oder BME enthält, der zu Kuppeln geformt wurde.

Ein zusätzlicher Tropfen BME umschließt den Ring in einer 3D-Struktur. Die Matrix kann jedes beliebige experimentelle Reagenz enthalten. Nach mehreren Tagen Inkubation können Gefäße beobachtet werden, die aus den Aortenringen aussprossen, und das angiogenetische Potenzial von Testsubstanzen kann bewertet werden.

Hallo, ich bin Karen Bein aus dem Labor von Dr. E. Lewis an der Abteilung für Klinische Biochemie der Beon-Universität des Negativen in Be'er Sheva, Israel. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für den murinen Aortaring-Assay. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Wirkungen verschiedener Substanzen auf die Bildung von Blutgefäßen zu untersuchen.

Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, lassen Sie den Basalmatrize-Extrakt (BME) auf Eis oder bei vier Grad Celsius auftauen. Sobald der BME aufgetaut ist, bewahren Sie ihn weiterhin gekühlt auf, um ein erneutes Erstarren zu verhindern.

Am Tag des Experiments euthanasieren Sie eine sechs bis sieben Wochen alte Maus durch eine Standardinjektion von Ketamin und Xylazin, anschließendes rasches Aushäuten über die Halsarterien und danach eine Halswirbel-Dislokation. Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie das Tier in einer sterilen Flüssigkeitsabsaughaube mit 70 %igem Ethanol abwischen. Arbeiten Sie danach unter einem Präparationsmikroskop und führen Sie mit sterilen Pinzetten und Präparierscheren einen vertikalen Schnitt durch die Haut und öffnen die Bauchdecke.

Der Schnitt sollte so geführt werden, dass das obere Brustbein freigelegt wird, wo ebenfalls der Rippenkorb durchtrennt und das Zwerchfell entfernt wird. Danach vorsichtig alle Organe zur Seite schieben, um die neben der Wirbelsäule verlaufende Aorta thoracica vollständig freizulegen. Mit der Aorta im Sichtfeld sterile, dünne Pinzetten zwischen Aorta und Wirbelsäule einführen. Die Pinzetten öffnen und die Aorta allmählich von ihrem Bett anheben, wobei das thorakale Segment von der übrigen Aorta abgetrennt wird.

Nachdem die Aorta gelöst ist, schneiden Sie sie mit einer scharfen Schere vom Tier ab, beginnend am Ende in der Nähe der Nierengefäße und endend in Herznähe. Legen Sie die entnommene thorakale Aorta in eine Petrischale, die mit kaltem sterilen PBS gefüllt ist. Nachdem die Aorta entfernt wurde, können aortale Ringstücke unter Verwendung zweier steriler Pinzetten und unter dem Binokular präpariert werden.

Reinigen Sie die Aorta thoracica vom umgebenden Fettgewebe. Achten Sie darauf, die Aorta nicht zu beschädigen, und halten Sie sie nur an den Rändern fest. Um Austrocknung zu verhindern, sollte die Aorta bis zur vollständigen Reinigung wiederholt in die mit PBS gefüllte Petrischale eingetaucht werden.

Nachdem die Aorta thoracica gereinigt ist, verwenden Sie ein chirurgisches Skalpell und arbeiten unter dem Binokular, um die Aorta gleichmäßig in einen Millimeter dicke Ringe zu schneiden. Verwenden Sie als Orientierungshilfe ein Lineal unter der Schneidefläche und achten Sie darauf, stets ein neues Skalpell zu benutzen und dieses von Zeit zu Zeit auszuwechseln, um die Schärfe zu gewährleisten. Die Enden der Aorta werden nicht verwendet. Nach dem Schneiden jedes Rings überführen Sie diesen vorsichtig mit einer Pinzette in eine neue Schale, die kalte PBS enthält.

Legen Sie alle Ringe in dieselbe mit PBS gefüllte Platte, um sicherzustellen, dass der Assay randomisiert wird. Da jedes Segment der Aorta ein leicht unterschiedliches angiogenes Potenzial aufweist, bewahren Sie die Ringe auf Eis auf. Bereiten Sie anschließend die Assay-Platte unter Verwendung vorgekühlter Pipettenspitzen vor.

Geben Sie in jedes Loch einer 48-Loch-Platte etwa einen Tropfen von 150 µL kaltem BME, bis der Tropfen zu einer Kuppel erstarrt. Das BME ermöglicht den Transport von Substanzen, die Chemotaxis von Zellen und, was am wichtigsten ist, die Differenzierung und Migration von Zellen, die zur Bildung neuer Gefäße führt. Randlöcher werden mit PBS gefüllt, um einer Austrocknung des BME vorzubeugen. Lassen Sie den BME-Tropfen 20 bis 30 Minuten bei 37 °C erstarren. Sobald das BME erstarrt ist, heben Sie vorsichtig einen Aortaring aus der Petrischale mit einer Pinzette heraus, um Schäden zu vermeiden, und überführen den Ring in den zwischen den Pinzettenenden entstehenden Lipidtropfen. Aufgrund der Flüssigkeitsoberflächenspannung wird ein einzelner Aortaring in die Mitte der Oberseite jeder Kuppel platziert und 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend werden auf jeden Ring zusätzlich 150 µL BME gegeben und weitere 20 bis 30 Minuten inkubiert.

Bei 37 Grad Celsius ist der Ring nun in BME und Assay eingebettet. Materialien können der Platte hinzugefügt werden, um den Assay zu starten. Ergänzen Sie das zuvor hergestellte humanes endotheliales, serumfreies Medium entweder mit dem experimentellen Material oder mit endothelialem Zellwachstumszusatz als positiven Kontrollansatz für eine negative Kontrolle.

Nur Medium verwenden. 500 Mikroliter des Pres-Supplement-Mediums zu jedem Well hinzufügen und sechs bis zwölf Tage bei 37 Grad Celsius inkubieren. Während dieser Inkubationszeit die Platte unter dem Mikroskop untersuchen und nach Gefäßen suchen, die aus der Aorta aussprossen, sowie nach fortgeschrittenen, reifen Gefäßen, die durch weitere verzweigte Gefäße identifiziert werden.

Sollte dreidimensional aus dem Ringgewebe herauswachsen; die Ringe zwischen Tag sechs und 12 unter einem Standard-Phasenkontrast-Stereomikroskop fotografieren. Zusätzlich die Überstände an verschiedenen Tagen zwischen Tag sechs und 12 sammeln und bei vier Grad zur Verwendung innerhalb eines Tages lagern oder bei minus 20 oder minus 80 für die spätere Verwendung lagern. Die Überstände können mit verschiedenen Methoden analysiert werden, wie beispielsweise ELISA für VGF oder Griess-Assay für Nitritkonzentrationen.

Diese Bilder wurden 12 Tage nach der Platzierung der Ringe in den Vertiefungen aufgenommen, nachdem sie entweder mit Kulturmedium (obere Bildreihe) oder mit ECGS, das als positiver Kontrollfaktor für die Gefäßaussprossung dient, inkubiert wurden. In der unteren Bildreihe. Jedes Bild zeigt eine repräsentative Aufnahme von vier der insgesamt 12 Ringe, wie sie typischerweise pro Bedingung im Assay verwendet werden.

Die Ecke jedes Aortenringes in jedem separaten Well ist schwarz. Bei dieser Art der Fotografie weisen Aortenringe, die ECGS ausgesetzt waren, ein Gefäßwachstum auf, und die Pfeile zeigen auf mehrere der zahlreichen gebildeten Gefäße. Jedes Gefäß zeichnet sich durch Ketten von Endothelzellen mit gelegentlichen Verzweigungen aus, was auf Reife hinweist.

Es können keine sprießenden Gefäße in der Kultur beobachtet werden. Medium-Vertiefungen im oberen Panel. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man den Aortenkor-Test durchführt, wenn man dieses Verfahren anwendet. Es ist wichtig, genau zu arbeiten und die Bedingungen zu verstehen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.