Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dreidimensionale Gewebekonstrukte aus aggregierten Zellen und zellulärer Matrix zu erzeugen, die für die funktionelle Analyse verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Polycarbonatform bearbeitet wird, um runde, ringförmige Vertiefungen herzustellen. Anschließend wird Polydimethylsiloxan oder PDMS auf die Polycarbonatform gegossen, um eine Vorlage zu erzeugen.

Dann wird die PDMS-Vorlage verwendet, um aros-Vertiefungen zu formen. Im letzten Schritt werden Zellen in die aros-Vertiefungen geimpft, um deren Aggregation und die Bildung kohäsiver Geweberinge zu ermöglichen. Letztendlich kann diese Methode genutzt werden, um die zelluläre Selbstorganisation und Gewebeengineering unter Verwendung verschiedener Zelltypen zu erreichen und die Beiträge von Zellen sowie von zellulär abgeleiteter extrazellulärer Matrix zur Gewebestruktur und -funktion zu analysieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Ansätzen des Gewebescreenings besteht darin, dass wir Gewebekonstrukte vollständig aus Zellen und der von ihnen produzierten extrazellulären Matrix schneller erzeugen können als bisher berichtet, und zwar in einem Format, das für mechanische Analysen geeignet ist. Beginnen Sie damit, ein halb Zoll dickes Polycarbonatstück zu fräsen, um 15 runde, ringförmige Vertiefungen mit einem mittigen Zapfen von zwei Millimetern Durchmesser herzustellen. Reinigen Sie die Polycarbonatschablone, um Kunststoffrückstände, die beim Fräsen entstanden sind, zu entfernen, und lassen Sie die Schablone trocknen. Mischen Sie anschließend PDMS im Verhältnis 10 zu 1 (Basis zu Härter). Entgasen Sie die Lösung, um alle Luftblasen zu entfernen, und gießen Sie sie dann in die Polycarbonatschablone.

Dann entgasen Sie die Mischung erneut an der Form, um verbleibende Luftblasen zu entfernen, und härten Sie das PDMS vier Stunden lang bei 60 Grad Celsius im Ofen aus, währenddessen das PDMS aushärtet. Lösen Sie 2 % AROS in DMEM. Nach der Aushärtung entfernen Sie die PDMS-Vorlage vorsichtig, indem Sie sie langsam von der Polycarbonatfläche ablösen, waschen Sie das PDMS mit Seife und Wasser und autoklavieren Sie es zusammen mit der DMEM-AROS-Lösung. Platzieren Sie nun die autoklavierte PDMS-Vorlage auf einer ebenen Fläche und füllen Sie sie mit geschmolzenem AROS, indem Sie zunächst AROS in jede der mittigen Stempelformen pipettieren und anschließend AROS in den Raum um diese herum pipettieren.

Lassen Sie die Aros etwa 15 Minuten lang erstarren. Danach stülpen Sie die Form um, um die Aros vom PDMS zu lösen. Schneiden Sie die überschüssigen Aros um jede Vertiefung herum ab und platzieren Sie anschließend eine Aros-Vertiefung in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte. Jetzt.

Geben Sie Zellkulturmedium um die Außenseite des Aros-Brunnens herum, ohne die Oberseite des Brunnens zu bedecken. Anschließend stellen Sie die Platten in den Inkubator, um sie zu equilibrieren, während die Zellen vorbereitet werden. Bei 90 % Konfluenz Trypsin, rat aortic smooth muscle cells und resus.

Suspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Pipettieren Sie anschließend 100 Mikroliter der resuspendierten Zellsuspension in jede der äquilibrierten Aros-Vertiefungen. Tragen Sie die Zellen unter Verwendung einer kreisförmigen Bewegung auf jede Vertiefung auf.

Stellen Sie die Platten 24 Stunden lang ungestört in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, indem Sie das Medium um die Vertiefung herum abpipettieren und anschließend jede Vertiefung erneut auffüllen, bis die Aros-Form vollständig untergetaucht ist. Füllen Sie am Ende der Kultur eine kleine Petrischale mit PBS.

Entfernen Sie jeden Ring von seiner Aros-Form, indem Sie ihn über die Spitze der Mittelsäule schieben. Legen Sie die Ringe in die Petrischalen mit PBS Center und platzieren Sie einen Ring unter dem digitalen Abbildungssystem. Verwenden Sie eine Kanten-Erkennungs-Software, um die Dicke des Rings an vier Positionen – oben, unten, links und rechts – entlang seines Umfangs zu messen.

Zur Durchführung einer einachsigen Zugprüfung. Befestigen Sie eine Ringprobe an zwei dünnen Drahtklammern. Dehnen Sie die Klammern so lange aus, bis eine Zugkraft von fünf Millinewton auf den Ring ausgeübt wird.

Geben Sie dann die aus den Dickenmessungen berechnete Querschnittsfläche ein und notieren Sie die Messlänge. Führen Sie acht Vorlastzyklen des Rings zwischen der Reißlast und 50 Kilopascal durch. Belasten Sie anschließend nach dem achten Vorlastzyklus mit einer Geschwindigkeit von 10 Millimetern pro Minute bis zum Bruch.

Bestimmen Sie für jeden Ring die Bruchdehnung und die maximale Zugfestigkeit und berechnen Sie aus den gewonnenen Daten den maximalen Tangentenmodul. Neben funktionellen In-vitro-Studien können diese Zellringe auch zu Geweberöhren verschmelzen. Schneiden Sie die Enden der Silikonröhrchen mit einer chirurgischen Schere schräg ab, um abgeschrägte Kanten zu erzeugen, und autoklavieren Sie anschließend die Silikonröhrchen, während die Röhrchen autoklaviert werden.

Füllen Sie eine Petrischale mit Medium, transferieren Sie sterilisierte, kundenspezifische Halter aus Silikonrohren in einen Biosicherheitsschrank und legen Sie sie in eine leere Petrischale. Entfernen Sie anschließend die Ringe aus den Aros-Vertiefungen und legen Sie sie in die mit Medium gefüllte Petrischale. Stellen Sie die Silikonrohre in dieselbe Petrischale, um sie vor der Verwendung anzufeuchten.

Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze eines Silikonschlauchs in die Mitte eines Rings zu platzieren, und schieben Sie den Ring vorsichtig auf den Silikonschlauch. Bringen Sie die Ringe durch vorsichtiges Verschieben in beide Richtungen entlang des Schlauchs nacheinander in Kontakt miteinander. Sobald die Ringe montiert sind, richten Sie die Silikonschläuche in den Polycarbonathaltern aus und schrauben die beiden Teile des Halters zusammen.

Geben Sie 55 Milliliter Medium in die Petrischale. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage während der gesamten Kultur, um die Gewebeschläuche zu entfernen. Füllen Sie zunächst eine Petrischale mit PBS.

Danach lösen Sie die Silikonschläuche aus dem Polycarbonathalter und verwenden eine Pinzette, um die Geweberöhren vom Silikonschlauch abzuschieben und in die Schale zu überführen. Bei korrekter Durchführung setzen sich die Zellen in den Boden der Aros-Vertiefungen ab und ziehen sich innerhalb von 24 Stunden nach dem Einsetzen zusammen, um einen Gewebering um den Mittelpfosten in der Agarro-Vertiefung zu bilden. Dies ist eine repräsentative Darstellung einer Spannungs-Dehnungs-Kurve, die aus einem einaxialen Zugversuch an einem zwei Millimeter breiten Gewebering gewonnen wurde, der aus glatten Muskelzellen der Ratte generiert wurde. Die Zugfestigkeit, der maximale Zugmodul und die Bruchdehnung werden anschließend verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von Geweberingen zu vergleichen, die unter verschiedenen Kulturbedingungen gezüchtet wurden.

Die mechanischen Eigenschaften von Geweberingen können durch die Variation von Kulturbedingungen gesteuert werden, einschließlich der Zellansiedlungszahl, der Kulturdauer, des Kulturmediums und des verwendeten Zelltyps. Neben Ratten-Smooth-Muscle-Zellen bilden humane primäre Smooth-Muscle-Zellen Geweberinge mit ähnlicher Zugfestigkeit.

Menschliche mesenchymale Stammzellen aggregieren ebenfalls zu Ringen, diese waren jedoch nicht stabil genug für mechanische Tests. Unser System ermöglicht die Herstellung von gewebetechnischen Konstrukten vollständig aus Zellen, indem Zellen einfach in unsere speziell angefertigten Aros-Vertiefungen gegeben werden. Sobald die ursprüngliche Polycarbonatform bearbeitet wurde, können wir eine unbegrenzte Anzahl an PDMS-Vorlagen herstellen, die anschließend zur Herstellung der Formen verwendet werden können, sodass keine zusätzliche Ausrüstung erforderlich ist.

Das System ist vielseitig einsetzbar, da wir eine Reihe unterschiedlicher Zelltypen im System zur Herstellung von Geweberingen verwendet haben, und könnte daher potenziell sowohl für Anwendungen im Bereich des Gewebeengineerings als auch für In-vitro-Studien der Beiträge von Zellen und extrazellulärer Matrix zur Gewebestruktur und -funktion genutzt werden.