Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Klinische Proteomik ist eine wichtige neue Disziplin, die die Entdeckung von Biomarkern verspricht, die für die frühe Diagnose und Prognose von Krankheiten nützlich sein werden. Hier berichten wir über eine neue Methode der digitalen Mikrofluidik oder DMF, die mehrere Verarbeitungsschritte integriert, wie sie in der klinischen Proteomik verwendet werden, einschließlich Proteinaufreinigung, Re-Solubilisierung, Reduktion, Alkylierung und enzymatischer Verdauung. DMF verwendet diskrete Mikrotropfen von Probenproteinen auf einem Elektrodenarray und kann bei Raumtemperatur betrieben werden, was die parallele automatisierte Analyse von Proben ermöglicht.

Diese Methodik stellt einen bedeutenden Fortschritt gegenüber herkömmlichen Methoden dar und könnte ein nützliches neues Werkzeug in der klinischen Proteomik sein. Hallo, ich bin Steve Sche aus dem Labor von Professorin Erin Wheeler am Department für Chemie und am Institut für Biomaterialien und Biomedizinische Technik an der University of Toronto. Hallo, ich bin Gabriel aus dem Wheeler-Labor an der University of Toronto.

Und ich bin Vivian Luke, ebenfalls aus dem Wearer-Labor an der University of Toronto. Ich bin Erin Wheeler. Ich habe das Glück, mit Steve Mace und Vivian zusammenzuarbeiten.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur proteomischen Aufarbeitung unter Verwendung digitaler Mikrofluidik. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Proteine und biologische Proben zu untersuchen. Beginnen wir also.

Beginnen Sie das Verfahren in der Abzugshaube, indem Sie die Glassubstrate in Piranha-Lösung reinigen. Unter Verwendung angemessener Schutzausrüstung besteht Piranha-Lösung aus drei Teilen konzentrierter Schwefelsäure zu einem Teil 30%iger Wasserstoffperoxid-Lösung. Daher ist beim Arbeiten mit dieser Lösung Vorsicht geboten.

Die Glas-Substrate 10 Minuten in Piranha-Ätzlösung inkubieren und nach der Reinigung mit deionisiertem Wasser oder destilliertem Wasser abspülen und die Substrate mit Stickstoffgas trocknen. Die Substrate in die Vakuumkammer für die Elektronenstrahlverdampfung geben und Chrom mit einer Dicke von 250 Nanometern aufdampfen. Die Substrate aus der Kammer entnehmen, sobald diese Dicke erreicht ist, mit Isopropanol abspülen und anschließend fünf Minuten lang bei 115 °C auf einer Heizplatte trocknen.

Beschichten Sie die getrockneten Substrate mit Hexamethylxylidin oder HMDS durch Auftragen mittels Spin-Beschichtung über 30 Sekunden. Führen Sie erneut eine Spin-Beschichtung mit Shipley S 1811 Photoresist unter identischen Parametern bei 3000 U/min durch.

Den Untergrund direkt auf einem Heizblock bei 100 Grad Celsius vorbacken. Danach den Fotolack durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder UV-Strahlung für fünf Sekunden durch eine Fotomaske belichten. Anschließend die durch UV-Licht belichteten Untergründe in Shipley MF 3 21 Entwickler entwickeln, ausreichend, um den Untergrund für drei Minuten danach einzutauchen.

Spülen Sie das Substrat im Anschluss in entionisiertem Wasser. Backen Sie es direkt für eine Minute auf einer heißen Platte bei 100 Grad Celsius. Ätzen Sie das freigelegte Chrom, indem Sie die Substrate für 30 Sekunden in ausreichend Chromätzmittel tauchen, um sie vollständig zu bedecken.

Spülen Sie die Substrate mit entsalztem Wasser und tauchen Sie sie in einen Z 300 T-Stripper, sodass das Substrat für 10 Minuten vollständig bedeckt ist. Um den verbleibenden Fotolack zu entfernen. Spülen Sie mit entsalztem Wasser und trocknen Sie mit Stickstoffgas.

Nach dieser Abscheidung werden zwei bis fünf Mikrometer Paraline C., ein isolierendes Polymer, auf das Substrat aufgebracht, indem 50 Nanometer Teflon AF durch chemische Gasphasenabscheidung abgeschieden werden, um die Oberfläche hydrophob zu machen, indem eine Lösung mit 1 % Gewicht pro Gewicht in Flourinert FC 40 bei 2000 U/min für 60 Sekunden auf das Substrat spin-coating aufgebracht wird.

Wiederholen Sie den Vorgang mit unbeschichtetem Indiumzinnoxid- oder ITO-Glas-Substrat, um die obere Platte herzustellen. Beide Substrate 10 Minuten lang auf einer Heizplatte bei 160 Grad Celsius aushärten, um das digitale Mikrofluidik-Gerät einzurichten.

Entfernen Sie Polymerschichten von den Kontaktflächen eines unteren Substrats, indem Sie mit einem Skalpell abkratzen. Koppeln Sie die freigelegten Kontakte des unteren Substrats mit 40-poligen Steckverbindern, die über einen Computer mit LabVIEW-Software mit Strom versorgt werden. Wir verwenden eine selbstgebaute Steuerbox, die Relais enthält, deren Signale über einen D-Pad gesteuert werden.

Die Computersteuerbox ermöglicht die Benutzersteuerung der Anwendung von 100 Volt Effektivwert pro 18 Kilohertz-Signal auf das Gerät über die 40-poligen Anschlüsse. Schalten Sie außerdem einen Funktionsgenerator und einen Verstärker ein. Bauen Sie das Gerät zusammen, indem Sie zwei Stücke doppelseitigen Klebebands mit einer Gesamtdicke von 140 Mikrometern an den Rändern des unteren Substrats positionieren.

Pipettieren Sie vier Mikroliter DI-Wasser in eines der Reservoirs und verschließen Sie das Gerät, indem Sie die ungemusterte Indiumzinnoxid-Platte mit der Teflon-beschichteten Seite nach unten auf das Gerät legen. Befestigen Sie einen Erdungsanschluss an der oberen Platte. Das im Labor erstellte Initialisierungsprogramm in LabVIEW dient zur Kalibrierung der Rückkopplungssteuerung; das Gerät ist nun bereit für Experimente.

In diesem Protokoll verwenden wir Rinderserumalbumin oder BSA als Proteinstichprobe, um unser Design und die Anwendung der digitalen Mikrofluidik zu demonstrieren. BSA wird in Arbeitspuffer oder WB verdünnt, der aus 100 Millimolar Tris-HCl, pH 7,8, mit 0,08 % (Gewicht pro Volumen) von Tween 27 besteht. Bereiten Sie jeweils ein Milliliter jeder Proben- und Reagenzlösung vor und kennzeichnen Sie das Reservoir, in das diese zugegeben wird.

Nach der Reagenzvorbereitung die obere Platte vom Gerät entfernen und vier Mikroliter der Lösung in das dafür vorgesehene Reservoir pipettieren. Nach dem Befüllen der Reservoirs die obere Platte wieder auf das Gerät setzen. Das hauseigene Laboransicht-Programm verwenden, um die folgenden Schritte auszuführen.

Denken Sie daran, dass die Computer-Schnittstelle es dem Benutzer ermöglicht, etwa 600 Nanoliter große Tröpfchen aus Reservoiren abzugeben und die Tröpfchen auf dem Elektrodenarray zu manipulieren. Geben Sie zunächst ein Tröpfchen der proteinhaltigen Probe aus R1 und ein Tröpfchen des Präzipitats aus R2 ab. Vereinigen Sie die beiden Tröpfchen und lassen Sie das kombinierte Tröpfchen fünf Minuten lang inkubieren, damit die Proteine an der Oberfläche ausfallen.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vom ausgefallenen Protein und leiten Sie ihn in das Abfallreservoir ab. Zum Waschen des ausgefällten Proteins geben Sie drei Tropfen Waschpuffer aus R vier ab, führen sie über das ausgefällte Protein und in das Abfallreservoir ab. Lassen Sie den Niederschlag trocknen und geben Sie einen Tropfen Puffer zur Wiederauflösung aus R fünf auf das Protein.

Lassen Sie den Puffer 20 Minuten lang inkubieren, bis sich der Niederschlag aufgelöst hat. Geben Sie anschließend einen Tropfen Reduktionsmittel aus R sechs ab und vereinigen Sie ihn mit dem Probentropfen. Mischen Sie den kombinierten Tropfen, indem Sie ihn zyklisch über sechs Elektroden bewegen.

Lassen Sie den Tropfen eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie einen Tropfen Alkylierungsmittel aus R7 ab, und vereinigen Sie ihn mit dem Proben-Tropfen, gefolgt von einer Mischung. Lassen Sie den Tropfen 15 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, inkubieren.

Schließlich geben Sie einen Tropfen Trypsin aus R acht ab und vereinigen Sie ihn mit dem Proben-Tropfen, gefolgt von einer Mischung. Lassen Sie den Tropfen drei Stunden bei 37 Grad Celsius in einer Petrischale auf einer Heizplatte inkubieren. Um die Reaktion zu beenden, entfernen Sie die obere Platte und beenden Sie die Verdauung durch Pipettieren.

0,6 mL 2,5 % Trichloressigsäure in Wasser auf den Reaktionströpfen geben. Das abgebrochene Reaktionsprodukt durch Absaugen des Proben-Tröpfchens direkt von der Unterplatte reinigen. Mithilfe einer C18-Zip-Spitze gemäß den Herstelleranweisungen können die Proben nun bedarfsgerecht verdünnt und mittels Massenspektrometrie analysiert werden, um die Proteine in der Probe mit diesem System zu identifizieren.

Anschließend wurden mittels Massenspektrometrie Proteine identifiziert, die Wahrscheinlichkeitsscores von weniger als einem Mal E hoch minus drei aufwiesen, was einem Konfidenzintervall von 99,9 % entspricht, sowie Sequenzabdeckungen von mindestens 30 %. Daher ist DMF eine äußerst nützliche Methodik für die automatisierte proteomische Probenvorbereitung. Wir haben heute lediglich gezeigt, wie wir die digitale Mikrofluidik nutzen, um Proteine automatisiert zu extrahieren und aufzubereiten. Diese Methodik bietet eine mögliche Lösung für Probenverluste und Kontaminationen während der Proteinisolierung und -identifizierung.

Wir hoffen, diese Methode in Zukunft auf andere biologische Anwendungen anzuwenden, einschließlich Immunoassays und zellbasierten Assays. Bei der Durchführung dieser Art von Experiment ist das Wichtigste, daran zu denken, es zu genießen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.