High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform
23. August 2012
Wir stellen eine mikrofluidische Ansatz für die Expression von Protein-Arrays. Die Vorrichtung besteht aus Tausenden von Reaktionskammern durch mikromechanische Ventile gesteuert. Mikrofluidische Vorrichtung mit einer Mikroarray-bedruckte Genbibliothek gepaart. Diese Gene werden dann transkribiert und translatiert auf dem Chip, was zu einem Protein-Array bereit zu Versuchszwecken verwendet.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein modulares Proteinarray zu erstellen, das keinen Reinigungsschritt erfordert und somit mit jeder Proteinbibliothek kompatibel ist. Dies wird erreicht, indem zunächst durch Assemblierungs-PCR synthetische Gene erzeugt werden. Anschließend werden die synthetischen Gene auf Epoxi-Plättchen angeordnet.
Zur Herstellung des mikrofluidischen Geräts verwenden Sie PDMS mit Silikon-Steuer- und Flussformen. Anschließend wird das mikrofluidische Gerät mit dem DNA-Array mit den aufgebrachten Spots ausgerichtet. Schließlich wird Kaninchen-Reticulozyten-Lysat durch das mikrofluidische Gerät geleitet und Proteine werden exprimiert.
Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Expression von Tausenden von Proteinen durch fluoreszente Antikörperfärbung zeigen. Die mikrofluidikbasierte Technik bietet mehrere Vorteile gegenüber etablierten Methoden wie Protein-Microarrays. Wir erstellen DNA-Microarrays und nutzen anschließend Cellis, um Proteine auf dem Gerät herzustellen.
Daher benötigen wir keine Proteinreinigung, und die Proteine trocknen niemals aus. Sie bleiben während des gesamten Experiments frisch. Die Mikrofluidik-Technik bietet zudem eine höhere Empfindlichkeit. Um die mikrofluidische Vorrichtung herzustellen, setzen Sie die Silikon-Steuerungs- und Strömungsformen 10 Minuten lang Chlorotrimethylsilan-Dampf aus, um die Freisetzung des Elastomers zu fördern.
Nach den Backschritten bereiten Sie eine Mischung aus silikonbasiertem Elastomer und Härtungsmittel in zwei verschiedenen Verhältnissen – fünf zu eins und 20 zu eins – für die Steuerungs- und Durchflussformen jeweils vor. Gießen Sie das fünf-zu-eins-PDMS auf die Steuerungsschicht. Entgasen Sie die Steuerungsschicht und backen Sie sie 30 Minuten bei 80 Grad Celsius.
Als Nächstes wird die 20:1-PDMS-Mischung auf die Flussschicht bei 2.600 U/min 60 Sekunden lang spinbeschichtet und anschließend 30 Minuten bei 80 Grad Celsius ausgehärtet. Danach wird die Steuerschicht vorsichtig von der Form gelöst, wobei darauf zu achten ist, dass das SU-8-Muster nicht abgezogen wird. Anschließend wird das Gerät mit einem Skalpell entlang des Umfangs ausgeschnitten und mit einer stumpfen Nadel unter dem Mikroskop Löcher gestanzt, um Zugang zu den Steuerkanälen zu erhalten.
Richten Sie die Fluss- und Steuerschichten manuell aus, beginnend mit der oberen linken Ecke, und positionieren Sie das Knopfventil auf der Steuerschicht in der Mitte der Reaktionskammer. Richten Sie danach die erste Zeile aus und lassen Sie die Steuerschicht zeilenweise vorsichtig los. Stellen Sie sicher, dass sich alle Knopfventile in der Mitte der Reaktionskammern befinden und dass die Adress- und Eingangsventile die Flusskanäle an der korrekten Position kreuzen.
Wiederholen Sie den Vorgang lokal, bis alle Reihen ausgerichtet sind. Wenn die Ausrichtung vollständig ist, lösen Sie die Spannung im PDMS vorsichtig, indem Sie es an den Seiten und Ecken anheben. Anschließend backen Sie das Gerät zwei Stunden bei 80 Grad Celsius, nachdem es gebacken wurde.
Schneiden Sie entlang des Umfangs und lösen Sie das zweilagige Gerät von den Durchflussform-Stanzlöchern, um Zugang zu den Durchflusskanälen zu erhalten, um DNA-Konstrukte für das Gerät herzustellen. Führen Sie eine PCR durch, um synthetische Gene herzustellen, die aus einem T7-Promotor, einer Ribosomen-Bindungsstelle, einem offenen Leserahmen mit unterschiedlichen Epitop-Tags an beiden Enden und einem T7-Terminator bestehen. Um die synthetischen Gene für die Anordnung vorzubereiten, stellen Sie eine Mischung aus Polyethylenglykol und D-Ribose-Dihydrat her. Geben Sie zwei Mikroliter pro Reaktion in die Vertiefungen einer 384er-Platte.
Mikrotiterplatte. Fügen Sie die synthetischen Gene in eine 384er-Mikrotiterplatte ein. Geben Sie dann destilliertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 20 µL zu erreichen.
Anschließend mithilfe eines Microarray-Spots eine Serie synthetischer Gene auf epoxi-beschichtete Glasuntergründe aufbringen. Unter einem Stereomikroskop das mikrofluidische Gerät manuell an das Gen-Array ausrichten, wobei der DNA-Spot in der Mitte der DNA-Kammern positioniert wird. Danach die übrigen Reihen ausrichten.
Abschließend erfolgt die Feinabstimmung des gesamten Geräts, um Spannungen im PDMS zu vermeiden und eine gute Haftung auf dem Mikroarray sicherzustellen. Lokal anheben. Schließlich das Gerät durch Inkubation über Nacht auf einer Heizplatte bei 80 Grad Celsius mit dem Objektträger verbinden.
Lebensmittelfarbstoffe werden in diesem Abschnitt zu Visualisierungszwecken verwendet. Die Ventile in der Steuerschicht werden über den Computer mittels LabView angesteuert. Das LabView-Skript steuert eine Reihe von magnetventilgesteuerten Mikroventilen über eine elektronische Steuerbox.
Der Magnetventilverteiler ist mit Druckluft verbunden, die den Luftstrom und den Druck in die Steuerventile des Geräts reguliert. Verbinden Sie das Gerät unter Verwendung eines flexiblen Kunststoffschlauchs mit einem Innendurchmesser von 0,02 Zoll und einer Edelstahlnadel mit dem Magnetventilverteiler. Füllen Sie die Schläuche mit doppelt destilliertem Wasser und stecken Sie die Nadel in die Zugangsöffnungen der Steuerschicht.
Stellen Sie sicher, dass jedes Reagenzglas mit dem entsprechenden Steuerungskanal verbunden ist. Um die Steuerungskanäle zu aktivieren, führen Sie die Lab-View-Anwendung aus, stellen den Luftdruck auf fünf PS.I ein und leiten anschließend Luftdruck durch Aktivieren des Ventils über das Lab-View-Skript. Dadurch wird Wasser in die PDMS-Steuerungskanäle gedrückt, um mögliche Übersprechen zwischen den Steuerungskanälen defekter Bauteile zu identifizieren.
Füllen Sie zuerst die Sandwich- und Adressventile. Da die Steuerkanäle und Ventile vollständig mit Wasser gefüllt sind, müssen die Ventile vorgefüllt werden, um die darunterliegenden Durchflusskanäle zu blockieren. Erhöhen Sie zunächst den Luftdruck auf 15 PSI und schalten Sie dann im LabView-Programm über eine Reihe von Ein-/Aus-Schaltern, die mit einzelnen Magnetventilen verbunden sind.
Aktivieren Sie alle Ventile, indem Sie alle Schalter einschalten, um sicherzustellen, dass alle Ventile geöffnet sind. Schließen Sie einen Schlauch an einen der Durchflusseingänge an und leiten Sie bei vier bis fünf PSI Luft in das Gerät. Dadurch werden eventuell festklebende Ventile von der Objektträgerplatte gelöst.
Das Gerät ist nun vorgefüllt und bereit für Visualisierungszwecke. Gelbe Lebensmittelfarbe wird verwendet, um die Reagenzien in diesem Abschnitt sichtbar zu machen, und die farblose Lösung repräsentiert die Hippies, um die Selbstorganisation eines Proteinarrays auf der Oberfläche zu erleichtern und unspezifische Adsorption innerhalb des mikrofluidischen Geräts zu verhindern. Modifizieren Sie die Oberfläche chemisch, indem Sie zunächst ein neues Rohr mit der erforderlichen Lösung an einen der Durchflusskanäle des Geräts anschließen. Anschließend verbinden Sie das freie Ende des Rohrs mit dem manuellen Verteiler und öffnen den Luftdruckdurchfluss.
Geben Sie 40 µL biotinyliertes BSA in ein neues Reagenzglas und leiten Sie etwa die Hälfte davon 20 Minuten lang durch das Gerät. Verwenden Sie 50 mmolare Hippies, um nicht umgesetztes Substrat zwischen den einzelnen Schritten abzuwaschen. Anschließend leiten Sie 25 µL Streptavidin 20 Minuten lang durch das Gerät.
Oberhalb des Buttons das biotinylierte BSA mit HES fünf Minuten lang waschen, um die Oberfläche um den Button herum zu passivieren, den Button-Ventil schließen und den Rest des biotylierten BSA durchfließen lassen, anschließend erneut fünf Minuten mit HEPES waschen. Schließlich, um einen Anti-His-Tag-Array unter dem Button zu erzeugen, den Button-Ventil öffnen und 30 Mikroliter Penta-His-Biotin 20 Minuten lang durchfließen lassen, um ein Proteinarray auf dem Gerät zu erzeugen. Die Halsventile öffnen und Kaninchenretikulozyten durchfließen lassen.
Schnelle gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktionslösung über das Gerät in die DNA-Kammer bringen. Anschließend die Sandwich-Ventile schließen, um jedes Gen von seiner Umgebung zu trennen, und das Gerät 2,5 Stunden lang bei 30 Grad Celsius auf einer Heizplatte inkubieren. Danach das endständige Terminus der Proteine mit dem Antikörper C-Mix-SI-drei markieren.
Schließlich unter Verwendung eines Mikroarrayscanners mit einem 532 Nanometer Laser und einem 575 Nanometer Emissionsfilter. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen. Diese Abbildung zeigt die unterschiedlichen Stufen der Proteinexpression auf einem Proteinarray.
In der Regel lässt sich bei 20 % einer Genbibliothek keine nachweisbare Expression feststellen. Die Hintergrundwerte wurden mithilfe von Kammern bestimmt, die nicht mit DNA bepunktet worden waren. Daher beruhen die Signale aus den entsprechenden Protein-Kammern entweder auf Rauschen oder auf unspezifischer Bindung der Markierungsantikörper.
Wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird, dauert die Geräteverifizierung vier Stunden und das Chip-Experiment fünf Stunden.
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Übersicht
Diese Studie stellt einen mikrofluidischen Ansatz für die Expression von Proteinarrays vor, bei dem ein Gerät mit Tausenden von Reaktionskammern verwendet wird, die durch mikromechanische Ventile gesteuert werden. Die Integration einer mikroarraygedruckten Genbibliothek ermöglicht die Transkription und Translation direkt auf dem Chip, wodurch ein einsatzbereites Proteinarray entsteht.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrofluidik
- Proteinausdruck
- Genbibliotheken
Hintergrund
- Proteinarrays sind für verschiedene biologische Assays unerlässlich.
- Herkömmliche Methoden erfordern häufig Reinigungsschritte, was die Verträglichkeit einschränkt.
- Mikrofluidische Vorrichtungen können den Prozess der Proteinexpression vereinfachen.
- Die Assembly-PCR wird verwendet, um synthetische Gene für die Array-Herstellung zu erzeugen.
Zweck der Studie
- Erstellung eines modularen Proteinarrays ohne Reinigungsschritte.
- Verbesserung der Kompatibilität mit jeder Proteinbibliothek.
- Steigerung der Effizienz der Proteinexpression unter Verwendung von Mikrofluidik.
Verwendete Methoden
- Erzeugung synthetischer Gene durch Assemblierungs-PCR.
- Anordnung synthetischer Gene auf Epoxi-Objektträgern.
- Herstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung aus PDMS.
- Durchströmen von Kaninchen-Reticulozyten-Lysat durch die Vorrichtung zur Proteinsynthese.
Hauptergebnisse
- Ein funktionelles mikrofluidisches Gerät wurde erfolgreich hergestellt.
- Proteine wurden direkt auf dem Chip ohne Aufreinigung exprimiert.
- Die Methode zeigte Verträglichkeit mit verschiedenen Proteinbibliotheken.
- Transkription und Translation auf dem Chip wurden effektiv realisiert.
Schlussfolgerungen
- Dieser mikrofluidische Ansatz vereinfacht die Erstellung von Proteinarrays.
- Er eliminiert die Notwendigkeit einer Reinigung und erhöht dadurch die Benutzerfreundlichkeit.
- Die Technik kann auf vielfältige Proteinbibliotheken in der Forschung angewandt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese mikrofluidische Plattform zur Proteingenerierung ermöglicht die hochdurchsatzfähige Herstellung funktionaler Proteinarrays ohne Reinigung und löst damit ein zentrales Engpassproblem bei der Target-Validierung und Interaktionsanalyse. Indem die Proteine chipintegriert in einem nativen, nicht denaturierten Zustand gehalten werden, unterstützt das Verfahren den zuverlässigen Nachweis von Protein-Protein-, Protein-DNA- und Protein-RNA-Interaktionen. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, da falsch-negative Ergebnisse durch Proteinverlust oder Fehlfaltung während der Reinigung vermieden werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Target-Validierung durch Expression von vollständigen Proteinen mit korrekter Faltung und posttranslationalen Modifikationen.
- Operationaler Wert: Eliminiert Reinigungsschritte, reduziert Probenverluste und erhöht den Durchsatz für die Hochdurchsatz-Screening von großen Bibliotheken.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Ent-Risikobewertung, indem quantitative Expressionsdaten für Tausende von Varianten parallel bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte Proteinarrays direkt aus DNATemplaten und gewährleistet so eine Konsistenz zwischen Chargen für reproduzierbare Interaktionsassays.
- Operativer Wert: Kombiniert Genanordnung und Proteinausprägung in einem einzigen mikrofluidischen Gerät, wodurch der manuelle Arbeitsaufwand und das Risiko einer Kreuzkontamination minimiert werden.
- Bereitschaft für Assays: Erzeugt quantifizierbare fluoreszierende Signale, die mit Mikroarrayscannern kompatibel sind und eine Interaktionskartierung mit hoher Dichte ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Ermöglicht eine schnelle Profilierung von Proteinwechselwirkungen an krankheitsrelevanten Zielstrukturen, die in vorgeschalteten Omics-Studien identifiziert wurden.
- Biomarker-Abstimmung: Unterstützt das Screening auf Autoantikörper oder therapeutische Bindungsereignisse unter Verwendung von patientenstammenden Proben auf exprimierten Antigenarrays.
- Präklinische Risikominderung: Ermöglicht eine frühe Bewertung von Off-Target-Bindungen oder Kreuzreaktivitätsprofilen, bevor Kandidaten weiterentwickelt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich nahtlos in den Entdeckungsprozess von der Herstellung synthetischer Genbibliotheken bis hin zur Interaktionsscreening ein und ermöglicht einen fließenden Übergang von der Zielidentifizierung zur Lead-Validierung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Expression angeordneter Gene, um die funktionelle Proteintätigkeit ohne Reinigungsartefakte zu bewerten.
- Screening: Stellt standardisierte, frisch hergestellte Protein-Arrays bereit, die sofort für biochemische oder biophysikalische Interaktionsassays verwendet werden können.
- Analytik: Bietet quantitative, fluoreszenzbasierte Messwerte, die den Vergleich von Expressionsniveaus und Bindungsaffinitäten unter Tausenden von Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Varianten mit funktionellen Proteinprodukten und ermöglicht so die Korrelation mit phänotypischen oder klinischen Daten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die mikrofluidische Plattform kann mit neuen DNA-Arrays neu programmiert werden und unterstützt so iterative Screening-Kampagnen über mehrere Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem Proteine im nativen Zustand exprimiert werden, wodurch Artefakte durch Reinigung oder Denaturierung verringert werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die parallele Bearbeitung von Tausenden von Reaktionen auf geringem Platzbedarf und verbessert so die Reagenzien-Effizienz und Durchsatzleistung.
- Strategischer Wert: Beschleunigt Go/No-Go-Entscheidungen durch die schnelle Generierung von Interaktionsdaten für große Variantenbibliotheken.
- Portfolio-Wirkung: Erleichtert die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf umfassenden Interaktionsprofilen und der Expressionstreue.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung mikrofluidischer Vorrichtungen, einschließlich PDMS-Abformung und Schichtenausrichtung.
- Hängt vom Zugang zu Mikroarray-Auftragsgeräten für die DNA-Array-Generierung und mikrofluidischen Steuersystemen (z. B. LabVIEW mit Magnetventilen) ab.
- Setzt standardisierte Protokolle für die Genbibliotheksherstellung voraus, einschließlich Assemblierungs-PCR und Epitopmarkierung zur Detektion.
- Beinhaltet die Optimierung von Inkubationszeiten und Reagenzkonzentrationen (z. B. Kaninchen-Reticulozyten-Lysat, biotinylierte Reagenzien) für spezifische Proteinexpressionsziele.
- Ist durch den begrenzten Zugang zu Einrichtungen für die Herstellung mikrofluidischer Systeme sowie durch die erforderliche technische Expertise für präzise Schichtenausrichtung und -verbindung eingeschränkt.
