Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Das Ziel dieses Videos ist es, die Methode zur Isolierung und Identifizierung von RNA- und Proteinbestandteilen ribonukleoproteiner Komplexe aus Zelllysaten mittels Immunpräzipitation zu demonstrieren. Hallo, mein Name ist Garrett Dom und ich bin Doktorand in der Abteilung für Molekularbiologie, Mikrobiologie und Immunologie an der University of Missouri, wo ich unter der Betreuung von Dr. Eli Sso forsche. Durch die Fortschritte in der Hochdurchsatzsequenzierung und der effizienten Microarray-Analyse ist die globale Genexpressionsanalyse zu einer einfachen und leicht verfügbaren Form der Datenerhebung in vielen Forschungs- und Krankheitsmodellen geworden.

Allerdings korrelieren die Stufen der mRNA des Zielgens nicht immer direkt mit den Proteinmengen im Gleichgewichtszustand. Eine posttranskriptionelle Genregulation ist eine wahrscheinliche Erklärung für die Diskrepanz zwischen beiden. Verursacht durch die Wechselwirkungen von RNA-bindenden Proteinen.

Die posttranskriptionale Regulation beeinflusst die mRNA-Lokalisation, -Stabilität und -Translation, indem sie einen ribonukleoproteinkomplex mit Ziel-mRNAs bildet. Die Identifizierung dieser unbekannten de-novo-mRNA-Ziele aus zellulären Extrakten innerhalb dieses Komplexes ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen und Funktionen des RNA-bindenden Proteins sowie dessen resultierender Auswirkungen auf die Proteinausbeute. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die als Ribo-Protein-Immuno-Präzipitation oder RIP bezeichnet wird und die Identifizierung spezifischer mRNAs ermöglicht, die im Ribonukleoproteinkomplex assoziiert sind.

Bevor das Experiment beginnt, ist es entscheidend, alle Reagenzien, Behälter und Utensilien bereitzuhalten. Behandeln Sie gläserne Geräte, die RNA-frei sein sollen, mit einem RNase-Inhibitor wie RNA ZAP von Ambion und spülen Sie sie anschließend mit DPCI-behandeltem Wasser ab. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien als RNA-frei bestätigt sind. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, den ribonukleoproteinkomplex aus dem zellulären Lysat zu gewinnen. Dazu werden exponentiell wachsende Gewebezellen geerntet, um für jede Probe zwei bis fünf Milligramm Gesamtprotein zu erhalten. Üblicherweise sind zwei P150-Kulturschalen ausreichend.

Hier ernten wir die menschlichen Brustkrebszelllinien MB 2 31 und MC seven und untersuchen die Ribonukleo-Interaktionen des RNA-bindenden Proteins. Dabei ist zu beachten, dass für jedes untersuchte RNA-bindende Protein die Gesamtzellzahl und Proteinkonzentration optimiert werden müssen, um die Wechselwirkungen zwischen dem entsprechenden Ziel-mRNA und dem RNA-bindenden Protein zu maximieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 U/min für etwa acht bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um sie zu pelletieren, und waschen Sie sie anschließend dreimal mit eiskaltem PBS. Nach dem letzten Waschschritt klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des Röhrchens und resuspendieren das Zellpellet in gleichen Volumina des vorbereiteten Polysomen-Lysepuffers mit RNasen- und Proteaseinhibitoren.

Es wird empfohlen, das exakte Volumen des Zellpellets abzumessen, vorsichtig pipettieren, um Zellklumpen aufzubrechen, und das Lysat fünf Minuten auf Eis zu inkubieren. Zentrifugieren Sie bei 13.000 ×g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um das Lysat von Zelltrümmern zu befreien, und überführen Sie das klare Überstand sofort in vorab gekühlte RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen. Diese auf Eis halten und bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Dieses Lysat kann bis zu sechs Monate bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen sollten vermieden werden, da sie zu einer Degradation von Proteinen und/oder mRNA führen können. Es ist am besten, die Immunpräzipitation unmittelbar durchzuführen.

Führen Sie eine schnelle Quantifizierung der Proteinkonzentration und des Lysats mit einem standardmäßigen Bradford-Protein-Assay durch. Als Nächstes müssen wir die Materialien zur Isolierung unseres spezifischen Zielproteins vorbereiten. Quellen Sie zunächst das Protein vor.

Sphero-Perlen über Nacht in NT2-Puffer mit 5 % BSA ergänzt bei vier Grad Celsius lagern. Verwenden Sie NT2-Puffer im Verhältnis vier zu eins mit PAS-Perlen. Eine Langzeitlagerung von bis zu mehreren Monaten bei vier Grad Celsius ist möglich.

Wenn vor der Verwendung mit 0,1 % Natriumazid versetzt, entfernen Sie überschüssiges NT2-Puffer, sodass das endgültige Verhältnis von Kügelchen zu Puffer eins zu eins beträgt. Verwenden Sie 1,5-Milliliter-RNA-freie Mikrozentrifugenröhrchen, entnehmen Sie 100 Mikroliter SRO-Speed-Slurry und geben Sie 30 Mikrogramm Antikörper pro einzelne IP-Reaktion hinzu. Beispielsweise verwenden wir in unserem Experiment einen Who-are-Antikörper, der ein Maus-IgG1-Antikörper ist.

Daher ist auch unser Kontrollantikörper ein IgG. Als Nächstes geben Sie 100 bis 200 Mikroliter NT2-Puffer zur Antikörper-Perlen-Mischung hinzu. Zusätzlich sollte parallel ein isotyp-matcher Antikörper oder normales Serum des gleichen Tierstamms als Antikörperkontrolle gegen Hintergrund-RNA verwendet werden.

Fügen Sie den geeigneten Antikörper zur Bead-Mischung hinzu und inkubieren Sie über Nacht unter Schütteln bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie die mit Antikörper beschichteten Beads unmittelbar vor der Verwendung vor, indem Sie sie fünfmal mit je einem Milliliter eiskaltem NT2-Puffer waschen; waschen Sie die Beads durch Zentrifugation bei 13.000 × g für ein bis zwei Minuten bei vier Grad. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer manuellen Pipette oder einem Aspirator.

Dieses Waschen hilft, ungebundene Antikörper sowie RNA-Kontaminanten aus der Antikörperlösung zu entfernen. Sobald der letzte Waschschritt abgeschlossen ist, resuspendieren Sie die Perlen in 700 Mikrolitern eiskaltem T2-Puffer und geben anschließend verschiedene RNA-Inhibitoren zur Schutz der Ziel-mRNAs hinzu, darunter 10 Mikroliter RNAs, 10 Mikroliter 100 Millimolar DTT und 15 Mikroliter EDTA. Stellen Sie das Volumen mit NT2-Puffer auf 900 Mikroliter ein.

Anschließend werden wir den Zielkomplex immunpräzipitieren. Wir empfehlen dringend die Verwendung eines Vorklärschritts, um das Hintergrundsignal in Ihrer RNA-Analyse nach dem RIP-Verfahren zu reduzieren; führen Sie den Vorklärschritt mit 15 Mikrogramm Isotypkontrolle 30 Minuten bei vier Grad Celsius durch. Geben Sie 50 Mikroliter vorquellende PAS-Beads, die nicht mit Antikörper beschichtet sind, hinzu.

30 Minuten bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren und anschließend in der Zentrifuge bei vier Grad Celsius mit 10.000 G zentrifugieren. Zwei Pellets erhalten. Das Überstand für IP aufbewahren.

Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter des isolierten, geklärten Lysats mit etwa zwei bis fünf Milligramm Protein der vorbereiteten Antikörpermischung hinzu. Das Verdünnen des Lysats hilft, die Hintergrundreaktion zu verringern. Wickeln Sie das Gefäß mit Parafilm ab, um einen dichten Verschluss zu gewährleisten, und inkubieren Sie es vier Stunden lang bei vier Grad Celsius unter Rütteln. Zentrifugieren Sie anschließend das Pellet fünf Minuten lang bei 5.000 × g und vier Grad Celsius und heben Sie das Überstandsvolumen für eine mögliche Analyse auf, indem Sie es bei minus 80 Grad Celsius lagern, wie zuvor beschrieben. Waschen Sie die Kügelchen fünfmal mit je einem Milliliter eiskaltem T2-Puffer unter Zentrifugation.

Entfernen Sie anschließend den Überstand mit einer manuellen Pipette oder einem Aspirator. Um den Hintergrund zu verringern, können strengere Methoden angewendet werden, indem dem NT2-Puffer Natriumdesoxycholat, Harnstoff oder SDS zugesetzt wird. Halten Sie die Proben so oft wie möglich auf Eis und arbeiten Sie schnell, um den Abbau der Ziel-mRNA zu minimieren.

Schließlich verwenden wir DNA- und Proteinase-K-Behandlungen, gefolgt von einer RNA-Fällung, um die ribonukleären Protein-RNAs zu isolieren, nachdem die Beads mit 100 Mikrolitern N NT zwei Puffer, ergänzt mit fünf Mikrolitern RNAs-freiem DNAs ein, gewaschen und resuspendiert wurden. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten. Geben Sie ein Milliliter N NT zwei Puffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 5.000 ×g für fünf Minuten.

Verwerfen Sie das Überstand-REES-Spin-Protein und das Pellet der SROs und geben Sie 100 Mikroliter NT2-Puffer mit fünf Mikrolitern Proteinase K (10 Milligramm pro Milliliter) und einem Mikroliter 10 % SDS hinzu. Inkubieren Sie die resuspendierte Perlenmischung 30 Minuten lang in einem 55 Grad Celsius warmen Wasserbad, wobei Sie alle 10 Minuten vorsichtig schwenken. Die Proteinase K unterstützt die Freisetzung der ribonukleoproteinhaltigen Komponenten. Zentrifugieren Sie die Perlen ab.

Zentrifugieren Sie mit 5.000 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und sammeln Sie den Überstand, dessen Volumen etwa 100 Mikroliter betragen sollte. Geben Sie als Nächstes zwei Perlen in 200 Mikroliter NT2-Puffer und zentrifugieren Sie bei 5.000 × g für zwei Minuten. Sammeln Sie anschließend ungefähr 200 Mikroliter des Überstands und entsorgen Sie die Perlen.

Vereinigen Sie Super Natin und geben Sie 300 Mikroliter saure Phenol-Unterschicht hinzu, mischen Sie kurz im Vortex. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und dann eine Minute bei Raumtemperatur mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Sammeln Sie 250 Mikroliter der oberen Schicht.

Seien Sie sehr vorsichtig, um die Grenzfläche nicht zu stören, da dies eine Kontamination verursachen würde. Geben Sie zum RNA-Probe 25 µL Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5,2, 625 µL gekühlten 100 %igen Ethanol und 5 µL GlycoBlue hinzu und mischen Sie gut. Lagern Sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.

Zusätzlich, um eine ordnungsgemäße Rückgewinnung der RNA sicherzustellen. Die Zugabe von GlycoBlue erhöht die Sichtbarkeit des RNA-Pellets, indem es als Trägermolekül wirkt; am folgenden Tag die Röhrchen durch dreimaliges bis fünfmaliges Umstülpen mischen, dann bei 12.000 × g und vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren und das Überstand entfernen. Ein Milliliter gekühlter 70 %iger Ethanol wird dem blauen Pellet zugegeben und durch Umstülpen oder Vortexen gemischt, anschließend zentrifugieren.

Probe bei 12.000 G bei vier Grad Celsius für zwei Minuten zentrifugieren. Überstand verwerfen und erneut bei 12.000 G für eine Minute bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Reste von 70 % Ethanol mit einer Pipette entfernen und das Pellet lufttrocknen.

Fügen Sie Raumtemperatur fünf Minuten lang hinzu. Wieder in 20 bis 40 Mikroliter RNAse-, DNA-freiem Wasser suspendieren. Die Probe ist nun bereit zur Quantifizierung mittels NanoDrop-Spektrometrie und weiteren downstream-Anwendungen wie der quantitativen Echtzeit-PCR oder Microarray-Analyse. Nach RNA-Isolierung, Microarray und quantitativer Echtzeit-PCR wurden die mRNA-Ziele des RNA-bindenden Proteins who are und deren resultierende Anreicherung aus der Immunpräzipitation ermittelt.

Die Bestätigung durch Western Blot zeigt eine saubere Isolierung des gesuchten Proteins. Die quantitative PCR demonstriert die Anreicherung des mRNA-Ziels Beta-Aktin im Vergleich zu IgG-Kontrollen. Während die Microarray-Analyse eindeutige genetische Profile zwischen den Brustkrebszelllinien MC7 und MB231 aufzeigt, hat sich die ribonukleoproteinspezifische Immunpräzipitation insgesamt als hervorragendes Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen RNA-bindenden Proteinen und ihren mRNA-Zielsequenzen etabliert – sowohl in unserer Gruppe als auch in vielen anderen Forschungsgruppen. Obwohl dieses Verfahren von Natur aus sensibel ist, führt eine korrekte Durchführung zu einer Isolierung dieser Ribonukleoprotein-Komplexe, die bis vor Kurzem für Entdeckung und Analyse unzugänglich waren.