Ein Multi-Parametric Islet Perifusion System innerhalb eines mikrofluidischen Perifusion Geräte

In dieser Präsentation stellen wir ein mikrofluidisches, auf der Augenlidperfusion basierendes System zur gleichzeitigen Messung der dynamischen Insulinsekretion, des Calciumeinstroms und der Änderungen des mitochondrialen Potentials von pankreatischen Inseln als Reaktion auf insulinsekretierende Substanzen vor. Das Perfusionssystem besteht aus einer dreischichtigen mikrofluidischen Vorrichtung, Spritzenpumpen und einem Bruchstoffsammler für Insulin. Mit einem fluoreszenzmikroskopischen Aufbau werden die durch Sekretagoge induzierten Calciumeinstrome und mitochondrialen Potentiale abgebildet.

Hallo, mein Name ist Ola, ein Waller aus dem Labor von Dr. Val Holter in der Abteilung für Transplantationschirurgie an der University of Illinois in Chicago. Hallo, ich bin Don Lee, ebenfalls aus dem Oktober-Labor. Hallo, ich bin Tricia Hart, ebenfalls aus dem Labor von Dr. Al Holster.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur simultanen Augenlid-Bildgebung unter Verwendung eines linearen Glukosegradienten. Wir haben dieses Verfahren in unserem Labor verwendet, um Augenlöcher und deren Funktion zu untersuchen. Beginnen wir also.

Die mikrofluidische Vorrichtung, die für dieses Verfahren verwendet wird, besteht aus drei Schichten gehärteten PDMS, die mittels Standard-Photolithographie hergestellt wurden. Die erste Schicht, die von einer Silikonform erzeugt wird, weist die Vertiefungen der mikrofluidischen Vorrichtung auf, die die Ösen sanft fixieren, mit einer Tiefe von 150 Mikrometern und einem Durchmesser von 500 Mikrometern. Die zweite Schicht weist Kanäle mit einer Höhe von 500 Mikrometern und einer Breite von zwei Millimetern auf.

Die Mitte des Kanals wird erweitert, um den Fluss zu verteilen und einen besseren Lösungsaustausch innerhalb des Geräts zu ermöglichen. Die Austauschmulde wird hergestellt, indem in der Mitte der Schicht ein Loch gestanzt wird, das drei Millimeter hoch und sieben Millimeter breit ist. Die dritte Schicht ist eine dicke Platte aus PDMS. Um diese Schicht vorzubereiten, stanzen Sie kleine Löcher auf beiden Seiten, die sich mit dem Einlass und dem Auslass des Kanals ausrichten.

In der zweiten Schicht, nachdem alle drei Schichten erzeugt wurden, wird die erste Schicht mit einer Glasplatte verbunden, wobei die Vertiefungen nach oben zeigen. Anschließend wird die zweite Schicht mit der ersten Schicht verbunden, wobei der Kanalabstand nach oben zeigt. Schließlich wird die dritte Schicht mit der zweiten Schicht verbunden.

Nachdem die Schichten verbunden wurden, ist das Gerät bereit, für Experimente verwendet zu werden. Sterilisieren Sie das mikrofluidische Gerät, indem Sie Ethanol durch die Kanäle des Geräts leiten, und verwenden Sie dazu eine 10-Milliliter-Spritze, die mit 70 %igem Ethanol gefüllt ist und über Tai-Schlauch mit dem Einlassanschluss des Geräts verbunden ist. Anschließend spülen Sie mit derselben Vorrichtung deionisiertes Wasser durch das Gerät, um das Ethanol auszuspülen.

Nachdem das Gerät sterilisiert wurde, platzieren Sie es mit Hilfe von Tigon-Schläuchen auf einem beheizten Mikroskopstadium, schließen Sie die Spritzenpumpen, die Lösungen mit hohem und niedrigem Glucosespiegel enthalten, an einen Y-Anschluss an und verbinden Sie diesen mit dem Eingang des mikrofluidischen Geräts. Verbinden Sie den Ausgang des mikrofluidischen Geräts mit einem Fraktionssammler.

Stellen Sie sicher, dass sich das Schlauchsystem auf einem 37 Grad Celsius heißen Heizblock befindet. Es ist sehr wichtig, die Lösungen während des gesamten Experiments auf physiologischer Temperatur zu halten. Verwenden Sie anschließend das LabView-Programm, um den Glukosegradienten zu starten, der während des Experiments durch das mikrofluidische Netzwerk perfundiert wird.

Diese Software variiert die Flussrate zweier Glucoselösungen. Durch die Steuerung der Spritzenpumpen können hier verschiedene Glucose-Konzentrationsgradienten erzeugt werden, darunter lineare, glockenförmige und rechteckförmige Gradientenprofile. Im Vergleich zu den berechneten erwarteten Werten wird in diesem Experiment der lineare Gradient von zwei Millimolar bis 25 Millimolar Glucose verwendet, wobei die Flussrate der beiden Glucoselösungen variabel mit 0,01 Milliliter pro Minute und die Flussrate nach dem Mischen der Lösungen konstant mit 0,25 Milliliter pro Minute in das Gerät eintritt.

Nachdem das geeignete Gradientenprofil ausgewählt wurde, überprüfen Sie die Stabilität des Gradienten. Starten Sie zunächst das Gradientensystem. Danach starten Sie den Fraktionssammler und sammeln Sie acht Milliliter Perfusat in Ein-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen.

Danach mithilfe eines Glukometers die Glukosekonzentration in jedem Reagenzglas unter Verwendung von Excel bestimmen. Die vom Glukometer erhaltenen Ergebnisse analysieren. Als Nächstes die Spritze mit hoher Glukosekonzentration durch eine Spritze ersetzen, die eine 0,5-%-BSA-Lösung in Krebs-Ringer-Puffer enthält, und 50 Milliliter mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute durch das Gerät perfundieren.

Dies verhindert eine unspezifische Absorption von Insulin an den Mikrokanalwänden, um die Genauigkeit bei der späteren Messung der sezernierten Insulinkonzentration nach der Perfusionsbehandlung mit BSA sicherzustellen. Ersetzen Sie es durch die Lösung mit hohem Glucosespiegel reus. Suspendieren Sie 25 bis 30 manuell ausgewählte Maus-Augenstücke in einem zwei Millimolar-Glucose-haltigen Krebs-Ringer-Puffer, der den Kalziumindikatorfarbstoff fira 2:00 AM und den Farbstoff zur Anzeige des mitochondrialen Membranpotentials rumine 1 2 3 enthält, und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation das Gerät vom Perfusionsystem trennen und die Inseln vorsichtig in das mikrofluidische Gerät einbringen, indem die Pipettenspitze, die die Inseln enthält, in die Einlassöffnung eingeführt wird, und die Inseln langsam zugegeben werden. Nach dem Beladen das Gerät wieder mit dem Perfusionsystem verbinden, wobei darauf geachtet werden muss, keine Blasen einzuführen. Als Nächstes die Spritzenpumpe starten, um die Inseln mit KRB, das zwei Millimolar Glukose enthält, zu perfundieren.

Dieser Schritt entfernt überschüssiges Farbstoffmittel aus dem Medium, legt die zu verwendenden Anregungs- und Emissionsfilter sowie Belichtungszeiten für das Experiment fest und stellt den Fraktionssammler so ein, dass er im Abstand von jeweils einer Minute Fraktionen sammelt, während gleichzeitig die Augenlöcher mit der Lösung mit niedrigem Glucosespiegel durchströmt werden. Verwenden Sie das Werkzeug für den interessierenden Bereich (Region of Interest, ROI) der einfachen PCI-Bildgebungssoftware, um die Bereiche oder Augenlöcher festzulegen, die Sie aufnehmen möchten.

Markieren Sie außerdem den Hintergrundbereich, der nach dem Waschen der Zellen für 10 Minuten subtrahiert wird, starten Sie den Fraktionssammler für den Glucosegradienten und beginnen Sie die Zeitrafferaufnahme. Nach 30 Minuten schalten Sie die Software und die Hochglukose-Spritzenpumpe aus. Fahren Sie mit der Perfusion durch niedrige Glukose fort, um die Wirkung der hohen Glukose auszuwaschen.

Nach 10 Minuten stoppen Sie den Fluss von niedrigem Glukosegehalt, indem Sie die Spritzenpumpe ausschalten. Exportieren Sie nach der Perfusion die Daten zur Analyse in Excel. Die Menge an in die Perfu-Acht freigesetztem Insulin kann mittels ELA-Mausösen bestimmt werden.

Sie wurden mit einem linearen Gradienten von zwei bis 25 Millimolar Glukose perfundiert, wie hier gezeigt. Der Kalziumeinstrom und die Insulinsekretion werden nach etwa 13 Minuten Perfusion, entsprechend sechs Millimolar Glukose, ausgelöst. Änderungen der mitochondrialen Potenziale sind bereits früher, wie erwartet nach etwa 11 Minuten, zu beobachten.

Diese Daten zeigen den Vorteil der Verwendung dieses mikrofluidischen Netzwerks zur Charakterisierung der Auglöcher-Physiologie. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie Sie unser mikrofluidisches Para-Perfusionsgerät zur Untersuchung der Auglöcher-Physiologie verwenden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass sich keine Blasen im Gerät befinden, da dies dazu führen könnte, dass sich die Auglöcher während eines Experiments bewegen.

Außerdem kann der Flury bis zu einem Milliliter pro Minute justiert werden, ohne die Ösen zu stören. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.