Hirnschnitt Stimulation mit einem mikrofluidischen Netzwerk-und Standard-Perfusionskammer

Das Hauptziel des Projekts, das wir Ihnen heute vorstellen werden, besteht darin, die Stimulation des Gehirns räumlich und zeitlich kontrollieren zu können. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass wir durch eine einfache Modifikation des ohnehin komplexen elektrophysiologischen Aufbaus dieses mikrofluidische Gerät in den verschiedenen Laboren verbreiten können, die tatsächlich diese Gehirnstimulation im lebenden Zustand anwenden. Hallo, ich bin Java Chek Mohammad aus dem Edington-Labor der Abteilung für Bioingenieurwesen an der University of Illinois in Chicago.

Heute werde ich Ihnen zeigen, wie wir ein einfach mikrofabriziertes mikrofluidisches Gerät zur Stimulation von Gehirnschnitten anwenden. Das Gehirnschnitt-Gerät, das wir heute demonstrieren werden, ist aus mehreren Gründen sehr nützlich, wobei der Hauptgrund darin besteht, dass es so modular ist, dass es problemlos in bestehende elektrophysiologische Aufbauten integriert werden kann, ohne dass weitere Modifikationen erforderlich sind. Außerdem vermeidet es die Verwendung von Schläuchen und Pumpen, die jedes mikrofluidische Gerät komplizierter machen würden.

Und da wir die passive Pumpmethode verwenden, benötigen wir keine Schläuche oder Pumpen. Und das Dritte ist, dass lediglich eine dünne PDMS-Membran zwischen einem Deckglas und einer standardmäßigen Perfusionskammer platziert wird, wie sie in einem standardmäßigen elektrophysiologischen Aufbau verwendet wird. Das Verfahren, das ich heute demonstrieren werde, beginnt mit einem C8-Master, der mithilfe des standardmäßigen SV8-Lithografieverfahrens hergestellt wird.

Und der Master, den wir heute hier haben, ist ein zweistufiger Master, wobei eine Ebene das Design der Kanäle, der Mikrokanäle, aufweist, und eine weitere Ebene die Gestaltung der VR-Öffnungen, die auf diesen Kanälen liegen, sodass die durch die Kanäle fließenden Lösungen durch die Via-Öffnungen austreten können. Wir stellen also diesen Master her, der auf einer Siliziumscheibe liegt, und verwenden anschließend Silikon oder PDMS, das auf dieses Bauteil gegossen wird, um die auf der Scheibe befindlichen Strukturen in das PDMS zu übertragen. Daher werden wir das PDMS auf dieses Bauteil aufbringen.

Dann nehmen wir die PDMS-Membran, die sich nach dem Aushärten gebildet hat, und binden sie an einen Deckgläser. Dann haben wir unser mikrofluidisches Gerät. Anschließend modifizieren wir eine standardmäßige Perfusionskammer, indem wir die Unterseite der Perfusionskammer mit einer dünnen PDMS-Schicht beschichten.

Und sobald wir diese modifizierte Perfusionskammer haben, nehmen wir das zuvor hergestellte mikrofluidische Gerät und verbinden es mit der Perfusionskammer. Bei der Herstellung des mikrofluidischen Geräts gibt es zwei kritische Punkte. Der erste ist, dass der Heizblock vor dem Einbringen des PDMS ausgeschaltet sein sollte, damit das PDMS nicht sofort aushärtet, sobald wir es auf den Wafer gießen.

Ein weiterer kritischer Punkt ist, dass die Abstandshalter, die wir an den vier Ecken des Siliziumwafers verwenden, eine Höhe aufweisen sollten, die geringer ist als die des höchsten Strukturmerkmals auf dem Siliziumwafer. Dies dient dazu sicherzustellen, dass die VR-Öffnungen erhalten bleiben, wenn wir den Aushärtungsprozess für das PDMS durchführen. Hier befinden wir uns in diesem modularen Reinraum mit weichen Wänden, und dies ist der Master, den wir mithilfe eines standardmäßigen AC8-Lithographieverfahrens hergestellt haben.

Es handelt sich um einen zweistufigen Master, wobei die erste Ebene das Design der Kanäle mit vier Zuläufen und einem Abfluss aufweist. Im mittleren Bereich aller vier Kanäle befinden sich Vias oder Pos, die auf den Kanälen stehen. Diese dienen als Ausrichtungsmarken, die während des Herstellungsprozesses erzeugt wurden.

Und nun zeige ich Ihnen, wie ich das Material entfernen und die PDMS-Aushärtung durchführen werde. Aufgrund des Randtropfen-Effekts ist die Dicke im äußeren Bereich des Wafers größer als bei den eigentlichen Bauelementen in der Mitte des Wafers. Daher werden wir diese Ausrichtungsmarken mithilfe der Reserv-Klinge entfernen. Um Platz für die Gewichte zu schaffen, verwenden wir diese Abstandshalter mit einer Höhe von 140 Mikron, die an den vier Ecken des Wafers platziert werden.

Sie müssen daher sicherstellen, dass die Rasierklinge nicht in die Nähe der eigentlichen Bauelemente gelangt. Nun werde ich die SVA-Partikel mit der Luftpistole entfernen, und der Wafer ist jetzt bereit für die Vorbereitung der PDMS-Form. Zuvor müssen wir jedoch diese Abstandshalter einsetzen, die 140 Mikrometer hoch sind.

Ich werde nun die vier Klebestreifen an den vier Ecken des Wafers anbringen. Danach überprüfe ich, ob der Klebestreifen ordnungsgemäß am Wafer haftet. Der Grund, warum der Klebestreifen 140 Mikrometer hoch ist, liegt darin, dass der zweistufige Master mit den Kanälen und dem VS 150 Mikrometer hoch ist.

Und wenn wir während der Aushärtung des PDMS ein Gewicht darauf platzieren, müssen wir sicherstellen, dass die PDMS-Schicht eben herauskommt. Dazu verwenden wir an den Ecken vier Abstandshalter mit gleicher Höhe. Nun zeige ich, wie wir das PDMS gießen und aushärten, um die Bauteile herzustellen.

Doch bevor ich dies tue, möchte ich Ihnen zeigen, wie wir die PDMS-Lösung hergestellt haben. Dazu nehmen wir 10 Teile der Basis und einen Teil des Härters und mischen diese gründlich, was aufgrund des Mischvorgangs zu zahlreichen Blasen in der PDMS-Lösung führt. Um diese Blasen zu entfernen, geben wir das PDMS in den Exsikkator. Nachdem das PDMS zehn Minuten im Exsikkator war, sind keine Blasen mehr vorhanden.

Und nun ist das PDMS bereit, für die Aushärtung verwendet zu werden. Jetzt zeige ich Ihnen, wie wir das PDMS auf den Wafer auftragen und aushärten, um die PDMS-Membran zu erhalten. Ich werde also das PDMS auf den Wafer geben und dann diese Transparentfolie verwenden, um das PDMS abzudecken.

Und dies hilft uns, das Gerät zu entfernen, das Gerät von der Folie zu trennen und anschließend die Gewichte auf die Folie zu legen. Der Grund, warum wir die Gewichte verwenden, besteht darin, eine gleichmäßige Dicke des PDMS zu erzielen. Ein weiterer kritischer Aspekt ist das Erhalten der Via-Öffnungen.

Überall dort, wo sich vs befinden, wünschen wir kein PDMS, und die Gewichte helfen uns dabei. Wie Sie hier sehen können, ist die Heizplatte ausgeschaltet, und der Grund dafür ist, dass wir nicht möchten, dass das PDMS sofort aushärtet; daher lassen wir sie ausgeschaltet. Anschließend müssen Sie sicherstellen, dass der Wafer flach ist, bevor Sie das PDMS aufbringen.

Und nun können wir das zuvor vorbereitete PDMS auftragen. Achten Sie darauf, das PDMS nahe genug an der Waferoberfläche abzugeben, damit keine Blasen entstehen. Der kritischste Punkt hierbei ist die Art und Weise, wie Sie die Transparentfolie auf das PDMS legen.

Sie müssen darauf achten, dass beim Platzieren des Blatts keine Blasen entstehen. Nun werde ich eine dieser Glasplatten platzieren und überschüssiges PDMS herausdrücken. Ich platziere drei weitere Glasplatten und stelle sicher, dass sich die Glasplatten bei diesem speziellen Master nicht bewegen.

Und für diese speziellen Merkmale haben wir festgestellt, dass das Platzieren dieser vier Glasabstandshalter den VS ermöglicht. Und so kann das überschüssige PDMS zwischen der Transparentfolie und dem Wafer entweichen. Wir warten ein bis zwei Minuten und können dann den Heiztisch für verschiedene Master und verschiedene Designs einschalten. Möglicherweise müssen Sie je nach gewünschten Via-Öffnungen die Anzahl der Glasabstandshalter erhöhen oder verringern. Nun ist der Heiztisch bereit, eingeschaltet zu werden, und ich werde eine Temperatur von 75 Grad einstellen.

Und sobald die Temperatur von 75 Grad erreicht ist, können wir den Timer auf eine Stunde einstellen und das PDMS aushärten lassen. Da wir das PDMS nun eine Stunde lang aushärten ließen, können wir die Heizplatte ausschalten und sie auf 50 Grad Celsius abkühlen lassen. Der Grund dafür ist, dass das SEA nicht reißen soll.

Wenn wir es sofort von 75 Grad auf Raumtemperatur absenken, können wir es jetzt ausschalten und warten, bis es auf 50 Grad Celsius abgekühlt ist. Da die Heizplatte nun auf 50 Grad Celsius abgekühlt ist, können wir die Gewichte von der Folie entfernen. Nun können wir das Wafer von der Heizplatte nehmen und es ist bereit zum Schneiden.

Jetzt ist die PDMS-Schicht bereit, von der C8-Masterform abgenommen zu werden, und wir müssen die Aluminiumfolie entfernen. Anschließend muss die Transparentfolie entfernt werden. Hier haben wir die Standard-Perfusionskammer.

Wir haben es so modifiziert, dass wir es ausrichten können. Die Löcher, Einlass- und Auslassöffnungen der mikrofluidischen Vorrichtung. Das hier sind also die vier Einlassöffnungen und eine Auslassöffnung auf der PDMS-Membran.

Und diese sollten mit den vier Zuleitungen und einer Ableitung an der Perfusionskammer übereinstimmen. Nun werde ich die Perfusionskammer schieben und sie dann mit den Löchern auf der PDMS-Membran ausrichten. Nachdem sie ausgerichtet sind, kann der Schnitt vorgenommen werden.

Jetzt können Sie die Kammer mithilfe einer Sonde herausnehmen. Stellen Sie sicher, dass alle Ränder der PDMS-Membran frei sind, damit sie entfernt werden kann. Sobald dies der Fall ist, können Sie einen Gefrierschrank verwenden, um die PDMS-Membran zu entfernen, und darauf achten, dass Sie die PDMS-Membran beim Herausnehmen von der Oberseite des Geräts sehr langsam bewegen, um ein Zerreißen der PDMS-Membran zu vermeiden.

Jetzt werde ich die PDMS-Membran mit den Hohlräumen, die mit den SC8-Mastern geformt wurden, darauflegen und sicherstellen, dass sie eben liegt. Der Grund dafür ist, dass beim Anbringen der Löcher für die Einlass- und Auslassöffnungen das PDMS auf der Seite, die mit dem Deckglas verbunden wird, nicht rau ist.

Wir müssen also sicherstellen, dass sich die Hohlräume auf der Oberseite befinden. Nun können wir die Einlass- und Auslassöffnungen anbringen, damit wir die Löcher deutlich erkennen können. Wir legen einen schwarzen Hintergrund ein.

Jetzt werde ich die Einlass- und Auslassöffnungen herstellen und sicherstellen, dass kein PDMS an der Öffnung verbleibt. Es ist daher notwendig, jegliches PDMS zu entfernen. Nun werden wir die PDMS-Membran auf ein anderes Transparentpapier übertragen.

Wir können also das Blatt und den Deckglaskipp mit Plasma behandeln und sie so auflegen, dass die Hohlräume weiterhin oben liegen. Sobald diese Oberfläche und der Deckglaskipp mit Plasma behandelt wurden, können wir diese beiden Oberflächen zusammenbringen, um das mikrofluidische Netzwerk zu bilden und die Luftblasen zwischen dem PDMS-Blatt zu entfernen. Die Transparenz kann mit Klebeband erreicht werden.

Dadurch wird sichergestellt, dass das PDMS-Blatt flach liegt und die Verbindung deutlich besser erfolgt. Verwenden Sie erneut Klebeband auf der Oberseite, um Staubpartikel von der PDMS-Membran zu entfernen. Nun können wir den Deckglaser einsetzen, den wir mit der PDMS-Membran verbinden werden.

Und nun sind diese beiden PDMS und das Glas bereit für die Plasma-Behandlung. Wir werden das PDMS und die Deckglasprobe mit diesem mikrowellenmodifizierten Plasmasystem plasmabehandeln, bei dem Sie sehen können, dass diese Glaswanne es uns ermöglicht, das Plasma innerhalb dieser Mikrowelle zu erzeugen. Und lassen Sie mich die Proben in die Kammer einbringen und im Inneren der Kammer ein Vakuum erzeugen.

Jetzt kann ich Sauerstoff einleiten. Das Plasmasystem ist nun betriebsbereit, und ich werde für dieses spezielle System 10 % Leistung und 10 Sekunden verwenden, um das Plasma sichtbar zu machen. Während die Plasmabehandlung läuft, erhöhen wir die Leistung auf hundert Prozent und schalten das Licht aus.

Und nun können Sie das Plasma unmittelbar nach der Plasmabehandlung sehen. Sie müssen die beiden Oberflächen, den Glasobjektträger und das PDMS, miteinander verbinden, da andernfalls die PDMS-Oberfläche aufgrund der Plasmabehandlung ihre Hydrophilie verliert. Sobald Sie den Glasobjektträger platziert haben, stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche blasenfrei miteinander verbunden ist.

Wenn Luftblasen vorhanden sind, können Sie diese entfernen. Stellen Sie es nun fünf Minuten lang beiseite und lassen Sie es verbinden. Hier haben wir die modifizierte Perfusionskammer, bei der wir die Basis der Kammer mit PDMS modifiziert haben.

Und dies wurde zuvor bereits durchgeführt. Wir stellten eine Transparentfolie auf einen ausgeschalteten Heizblock. Anschließend gossen wir das P-D-M-S-P-D-M-S darauf, das in ähnlicher Weise wie zuvor gezeigt hergestellt wurde.

Dann haben wir die Perfusionskammer auf die PDMS-Schicht gelegt und ein einzelnes Gewicht wie hier gezeigt platziert und ließen es 30 Minuten bei 75 Grad Celsius aushärten. Während wir nun darauf warten, dass die PDMS-Schicht mit dem Deckglas verbunden wird, kann ich bereits zeigen, wie man die Kammer vorbereitet. So können wir die Kammer mit dem mikrofluidischen Gerät verbinden.

Daher müssen wir überschüssiges PDMS von allen Stellen entfernen, an denen es nicht benötigt wird. Entfernen Sie zuerst die Transparenzfolie und danach das PDMS. Anschließend muss das PDMS von den Einlass- und Auslassöffnungen entfernt werden. Nun ist die Kammer bereit, mit dem zuvor vorbereiteten mikrofluidischen Gerät verbunden zu werden.

Nachdem wir nun fünf Minuten gewartet haben, kann das mikrofluidische Gerät von der Transparentfolie getrennt werden. Dabei müssen Sie darauf achten, die Folie langsam zu entfernen, damit sich das PDMS und der Deckgläser nicht voneinander lösen. Da die Perfusionskammer nun bereit ist, müssen wir die untere Oberfläche der Kammer, an der wir das PDMS aufgebracht haben, sowie die obere Oberfläche des mikrofluidischen Geräts, die das PDMS enthält, einer Plasmabehandlung unterziehen.

Jetzt werden wir beide Teile in die Plasma­kammer geben und die Plasma­behandlung bei 10 % Leistung für 10 Sekunden durchführen. Beide Oberflächen wurden nun mit Plasma behandelt und sind bereit zum Verbinden. Vor dem Verbinden müssen Sie sicherstellen, dass die Einlass- und Auslass­öffnungen der Kammer mit der Mikrofluidikvorrichtung ausgerichtet sind.

Und da die Merkmale, die wir ausrichten, groß genug sind, benötigen wir keine spezielle Ausrüstung und können dies mit bloßem Auge durchführen. Sobald Sie die Ausrichtung vorgenommen und die Probe auf der Kammer platziert haben, stellen Sie sicher, dass alle Oberflächen in Kontakt sind, und lassen Sie sie dann fünf Minuten lang ruhen. Die Verbindung ist nach einer Wartezeit von fünf Minuten ausreichend stabil für die Experimente.

Nachdem das mikrofluidische Gerät mit der Kammer verbunden wurde, machen wir die Kanäle auf der Kanaloberfläche hydrophil. Damit fließen die A-CFS-Lösung oder andere Neurotransmitter später leichter hindurch. Dazu werde ich das gesamte Gerät in das Plasma geben und es eine Minute lang bei 10 % plasmabehandeln, sodass die kompletten inneren Kanaloberflächen hydrophil werden.

Und dann werde ich es mit Wasser auffüllen und anschließend zur Elektrophysiologie-Aufbauten bringen, damit wir die eigentlichen Experimente durchführen können. Gut, jetzt sind wir bereit, zum Elektrophysiologie-Aufbau zu gehen und dieses Gerät tatsächlich mit dem Gehirnschnitt zu verwenden. Hallo, mein Name ist uo.

Ich arbeite mit Dr. Arrington und Dr. Fall aus der Abteilung für Bioingenieurwesen an der University of Illinois. Nun werde ich mit dem mikrofreien Gerät arbeiten, das hergebracht wurde, und es gerade über diese Plattform platziert hat. Auf einer Seite können wir die Perfusionsleitung sehen.

Auf der anderen Seite sehen wir den Saugschlauch. Das Gerät wird also mit einer Zerebrospinalflüssigkeitslösung perfundiert, die mit 95 % Sauerstoff und 5 % CO2 angereichert ist. Nun, da das Mikro-V-Gerät bereit ist, hole ich das Gehirngewebe und lege es dann auf das Mikrogerät.

Jetzt werde ich die Gehirnscheibe auf die kreisförmigen Öffnungen legen und dann den Anker verwenden, um die Gehirnscheibe zu fixieren. Da die Gehirnscheibe nun fixiert ist, werde ich Neurotransmitter verwenden, um sie zu stimulieren. Hier haben wir vier Zulauföffnungen, daher werde ich mittels passiver Pumpung über diese vier Zulauföffnungen bis zu diesem Ablauf jeweils Neurotransmitter in jede Zulauföffnung geben.

Und nun wird Dr. Fall über dieses Gerät sprechen. Was ist für uns so wichtig? Hallo, ich bin Chris Fall und wir beschäftigen uns mit Hirnphysiologie.

Der Grund, warum wir Gehirnschnitte verwenden müssen, liegt in dem Zugang, den sie zu Mikroelektroden und bildgebenden Verfahren ermöglichen. Bislang war die einzige Möglichkeit, die Neurotransmitterumgebung dieser Gehirnschnitte zu verändern, entweder die Umströmung des gesamten Schnitts zu ändern oder Neurotransmitter mithilfe einer sehr kleinen Mikropipette direkt anzuströmen. Daher freuen wir uns sehr, mit der Arbeitsgruppe von Eddington zusammenzuarbeiten.

Diese neue Technologie ermöglicht es uns, große Bereiche des Gehirns anzusprechen und lokal die Neurotransmitterumgebung zu verändern. Gleichzeitig können wir nun mit unseren Elektroden und unserer Bildgebungstechnologie eingreifen und möglicherweise letztendlich mehrkanalige Ableitvorrichtungen in dieselbe Einheit integrieren. Gut, hier sehen Sie eine Schnittpräparation einer Maus im mikrofluidischen Gerät.

Sie können bereits mit bloßem Auge erkennen, dass das Gehirn aus vielen verschiedenen Regionen besteht. Diese Regionen übernehmen unterschiedliche Funktionen. Und bei einem lebenden Tier hätten diese verschiedenen Gehirnregionen unterschiedliche neuromodulatorische und neurotransmittervermittelte Töne.

Und wir möchten dies in unserer Schnittkammer replizieren können, während wir elektrophysiologische und bildgebende Aufzeichnungen durchführen. Daher ist es äußerst vorteilhaft, diese verschiedenen Bereiche mit unterschiedlichen Neurotransmittern, in verschiedenen Konzentrationen und mit unterschiedlichen zeitlichen Verläufen gezielt ansprechen zu können. Obwohl wir Neurotransmitter nicht direkt sichtbar machen können, können wir Ihnen hier ein Beispiel eines fluoreszierenden Farbstoffs zeigen, der in verschiedene Regionen des Gehirnschnitts eingepumpt wird.

Hier sehen Sie einen Film, in dem wir einen fluoreszierenden Farbstoff durch die Kanäle des Geräts strömen lassen und veranschaulichen, wie dieser aus den angefertigten Poren austritt. Selbst bei diesem frühen Prototyp ist erkennbar, wie präzise die räumliche Auflösung mit der Strömung ist. Während wir den Film betrachten, werden Sie sehen, wie der Farbstoff in die Kanäle und anschließend aus den Löchern strömt, woraufhin wir den Farbstoff wieder ausspülen, um Ihnen eine Vorstellung von der zeitlichen Auflösung der Strömung zu vermitteln.

Vielen Dank, dass Sie heute dabei waren. Ich denke, wir konnten zeigen, wie Mikrofluidik und tatsächlich auch Mikromaschinen mit traditionellen physiologischen Techniken kombiniert werden können, um uns zu helfen, zu verstehen, wie das Gehirn funktioniert. Vielen Dank.