Präsynaptisch Stille Synapsen mit Lichtmikroskopie Studium

Einige präsynaptische Endigungen im zentralen Nervensystem erscheinen funktionslos oder stumm. Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung stummer präsynaptischer Endigungen vor. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um Behandlungen und Manipulationen zu identifizieren, die verdächtigt werden, Endigungen zu stummen zu machen oder zu aktivieren.

Das Protokoll kombiniert die Vitalfarbemarkierung von synaptischen Vesikeln während der neuronalen Depolarisation mit einer anschließenden Markierung fixierter Zellen mittels eines Antikörpers, der alle präsynaptischen Endigungen – sowohl stille als auch aktive – markiert. Synapsen, die sowohl mit Farbstoff als auch mit Antikörper markiert sind, sind aktiv. Synapsen, die nur durch den Antikörper markiert sind, sind stille.

Hallo, ich bin Amanda Taylor aus dem Labor von Dr. Steve Minick an der Abteilung für Psychiatrie an der Medizinischen Fakultät der Washington University. Ich bin Shahin, ebenfalls aus dem Manic-Labor. Heute möchten wir Ihnen die Vorgehensweise zur Visualisierung stiller präsynaptischer Enden unter Verwendung kultivierter hippokampaler Neuronen zeigen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zu untersuchen, wie elektrische Aktivität und andere einzelne Signalwege die Freisetzung von Neurotransmittern modulieren. Beginnen wir also. In einer sterilen laminarer Luftströmungshaube verwenden Sie HIPA, um Ratten oder Mäuse vom postnatalen Tag null bis drei zu verwenden, um dissoziierte Zellkulturen herzustellen.

Entsprechend unserem veröffentlichten Protokoll handelt es sich bei unseren Kulturen um gemischte Gliazellen, die aus denselben Dissektionszellen stammen und in sterilen 35-Millimeter-Dishs mit einer Deckglasnummer 0, die mit fünf Milligramm pro Milliliter Kollagen beschichtet wurde, ausgesät werden sollten. Die Neuronen mit einer ungefähren Dichte von 500 Zellen pro Quadratzentimeter.

12 Rattenwelpen liefern typischerweise 30 bis 35 Millimeter-Dishs. Lassen Sie die Kulturen 10 bis 14 Tage lang in einem Kulturinkubator wachsen. Für die synaptische Entwicklung und Reifung geben Sie am vierten Tag in vitro das antimetotische a C hinzu, um das Wachstum der Gliazellen zu stoppen.

Außerdem am fünften Tag in vitro einen halben Mediumwechsel mit Neuro-Basal-Medium plus B27-Zusatz durchführen, um das Überleben der Neuronen während dieser Reifungsphase zu verbessern. Behandlungen einleiten, die die Anzahl präsynaptisch stiller Synapsen verändern. Wir stellen fest, dass eine praktische Methode, einen großen Prozentsatz der Glutamatsynapsen zu stillen, eine vierstündige Behandlung mit 30 Millimolar Kalium darstellt.

Wenn die Kulturen ausgereift sind, sollten die Neuronen eine relativ geringe Dichte aufweisen mit gut getrennten und ausgedehnten neuritischen Fortsätzen. Entnehmen Sie die Kulturen dem Inkubator und bringen Sie sie zum Arbeitsplatz. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch eine gepufferte Salzlösung, die 45 Millimolar Kaliumchlorid und 10 Mikromolar FM 1 43 FX Farbstoff enthält.

Diese Lösung sollte ebenfalls NBQX und A PV enthalten, um wiederkehrende Signalübertragung zu verhindern. Es ist wichtig, dass die FM 1 43 FX-Stammlösung und die Experimente vor Licht geschützt werden, um eine Photobleiche zu vermeiden. Decken Sie die Kulturschalen daher für alle nachfolgenden Inkubationsschritte mit Folie ab.

Incubieren Sie genau zwei Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Farbstofflösung und waschen Sie nur drei bis fünf Sekunden in gepuffertem Salin mit 500 Mikromolar Adversive.Seven. Um unspezifische Färbung zu entfernen, ist in diesem Schritt die genaue Zeitkontrolle entscheidend.

Da eine längere Exposition gegenüber adv adverse F sieben alle FM 43 FX-Färbungen entfernen wird, waschen Sie die Zellen anschließend zweimal im Abstand von jeweils zwei Minuten mit gepuffertem Salin ohne adv adverse. Sieben in einem Abzug.

Fixieren Sie die Kulturen mit 4 % Paraldehyd und 0,2 % Glutaraldehyd in PBS für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen kurz mit PBS. Die Zellen können nun aus dem Abzug entfernt werden.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu, die 4 % normales Ziegenserum und 0,04 % Triton X enthält, um die Hintergrundfärbung zu verringern und die Zellen für die Immunfärbung permeabilisieren. Inkubieren Sie 15 Minuten lang. Färben Sie die Zellen mit dem primären vlu-T-Antikörper, der in der Blockierungslösung im Verhältnis 1:2000 verdünnt ist.

Inkubieren Sie die Kulturen drei Stunden lang unter leichtem Schwenken mit Antikörper. Waschen Sie die Zellen viermal mit PBS. Inkubieren Sie die Zellen mit Alexa.

6 47 konjugiertes anti-Meerschweinchen-Antikörper, im Blockierungspuffer 1:500 verdünnt. Inkubieren Sie die Kulturen unter leichtem Schütteln 30 Minuten lang mit dem sekundären Antikörper. Waschen Sie die Zellen anschließend viermal mit PBS.

Platzieren Sie mit einer Pinzette einen kleinen Tropfen des Bodenmaterials auf einem sauberen Objektträger. Nehmen Sie einen Deckgläser auf und senken Sie ihn vorsichtig auf den Tropfen des Bodenmaterials, sodass die Zellen der Probe dem Objektträger zugewandt sind. Lassen Sie den Objektträger über Nacht trocknen.

Bereiten Sie ein 60x-Ölimmersionsobjektiv an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop vor. Platzieren Sie eine Objektträgerplatte auf dem Objekttisch, sodass die Deckglasseite zum Objektiv zeigt. Suchen Sie ein Feld von Neuriten, das nicht übermäßig dicht ist und sich entfernt vom Soma befindet, da dieses Restfarbstoff zurückhalten kann.

Vergrößern Sie auf eine Feldgröße von 51 mal 51 Mikrometern. Erstellen Sie mithilfe einer Bildaufnahmesoftware einen Z-Stapel, der eine Tiefe von 7,8 Mikrometern in 27 Schritten mit jeweils 0,3 Mikrometern abdeckt.

Scannen Sie zuerst mit dem VLU T one-Antikörper, um alle glutamatergen Synapsen im Feld zu identifizieren. Scannen Sie anschließend erneut zur Analyse der Bilder nach der Aufnahme auf Fluoreszenz von FM 1 43 FX. Verwenden Sie Analyse-Software, um aus dem Z-Stapel basierend auf der maximalen Intensitätsmessung jeder Ebene bei jedem Pixel einen zusammengesetzten Einzelebenen-Bild hervorzurufen, entsprechend dem eingestellten Schwellenwert.

Um die Hintergrundfärbung zu verringern, identifizieren Sie VGluT1-Terminale, ohne Bezug auf die FM1-43-Effekte zu nehmen, und markieren Sie diese Puncta als interessierende Bereiche. Üblicherweise wählen wir 10 Puncta pro Feld aus.

Wiederholen Sie die Schwellenwertbestimmung und die Auswahl der Punktstrukturen im FM 1 43-Wirkungsbild und überlagern Sie die Bilder, um stille Synapsen zu identifizieren. Ein absoluter Pixelkriterium oder ein prozentuales Pixelkriterium kann verwendet werden, um aktive FM 1 43-positive von inaktiven FM 1 43-negativen Synapsen zu unterscheiden. In unseren Kulturen stellen wir fest, dass 70 bis 80 % der durch Vglut1-Färbung definierten Glutamatsynapsen in überlagerten Bildern aus grüner FM 1 43-Fluoreszenz und roter Vglut1-Färbung nachweisbare FM 1 43-Färbung aufweisen.

Dies zeigt sich durch eine Fülle gelber punktförmiger Synapsen mit koinlokalisierten Markern. Diese werden durch die Pfeile angezeigt. Etwa 20 bis 30 % der roten Vglut1-positiven Punktstrukturen weisen keine grüne FM 1-43-Fluoreszenz über dem Grundniveau auf.

Dies sind die inaktiven präsynaptischen Endigungen, und ein Beispiel ist durch den Pfeil markiert. Eine dritte Population von Synapsen wird ebenfalls beobachtet. Diese zeigen grüne FM 1 43-Fluoreszenz, weisen jedoch keine rote B-Glut-eins-Färbung auf.

Dies sind aktive GABAerge Synapsen, und ein Beispiel ist mit einem Sternchen markiert. Diese werden von den meisten unserer Analysen ausgeschlossen, können aber gezielt mit einem Antikörper gegen den vesikulären GABA-Transporter untersucht werden. Anstelle des VLU T one-Antikörpers haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie präsynaptisch stille Synapsen mithilfe von FM 1 43 und VLU one-Immunfärbung sichtbar gemacht werden können.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass FM 1 43 FX empfindlich gegenüber der Dauer in der Adver sub seven-Waschung sowie gegenüber der Konzentration des in der Blockierungslösung enthaltenen X 100 ist. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.