Herstellung und Betrieb eines Oxygen Insert für adhärente Zellkulturen

Die hypoxische Insert-Vorrichtung verfügt über sechs Säulen, die in die Vertiefungen einer sechs-Loch-Platte eingefügt werden. Das Gas strömt durch das mikrofluidische Netzwerk an der Basis der Säule und kann durch die gasdurchlässige PDMS-Membran diffundieren, die das Gasnetzwerk und das Kulturmedium voneinander trennt. Diese Vorrichtung verkürzt den Diffusionsweg zwischen der Sauerstoffquelle, dem mikrofluidischen Netzwerk an der Basis der Säule und den Zellen, wodurch eine schnellere Sauerstoffkonzentrationsanpassung ermöglicht wird.

Das Gerät ermöglicht außerdem eine weitaus größere Kontrolle über das räumliche Muster des Sauerstoffs, dem die Zellen ausgesetzt sind, welches durch das Design des mikrofluidischen Gassystems bestimmt wird, das mittels Standard-Photolithographie unter Verwendung von Fotomasken hergestellt wird. Hallo, ich bin Sean Ard aus dem Labor von Dr. David Edington am Department für Bioingenieurwesen an der University of Illinois in Chicago. Hallo, ich bin Ellie, ebenfalls aus dem Edington-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie ein benutzerdefiniertes Gerät herstellen, validieren und nutzen, um in vitro Zellkulturen in einer sechsfachen Platte unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen auszusetzen. In unserem Labor haben wir dieses Verfahren verwendet, um den Einfluss von Sauerstoff auf die Wundheilung, die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und die Zellmigration zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um mit der Herstellung des oxygenierenden Einsatzes zu beginnen, bereiten Sie Polymethylsiloxan oder PDMS im Verhältnis 10:1 zwischen Präpolymer und Härter vor. Gemäß den Herstelleranweisungen wird die PDMS-Mischung einer zuvor maschinell bearbeiteten Dell-Ran-Form hinzugefügt, die so strukturiert ist, dass sie der Form einer standardmäßigen sechswelligen Kulturplatte nachempfunden ist. Nach dem Aushärten bei 75 Grad Celsius über Nacht bildet das resultierende abgeformte Säulenarray die erste von drei Komponenten, aus denen der oxygenierende Einsatz besteht, um die zweite Schlüsselkomponente des oxygenierenden Einsatzes herzustellen.

Ein SU-8-Master wird hergestellt, indem zunächst SU 8 21 50 auf einem Siliziumwafer aufgespint. Anschließend wird eine Fotomaske auf den Wafer aufgebracht, und das SU 8 wird durch die Fotomaske hindurch UV-Licht ausgesetzt, um einen Negativabdruck mit einer Mikrokanal-Dicke von 300 Mikrometern zu erzeugen. Danach wird PDMS auf den SU-8-Master gegossen und zwei Stunden bei 75 Grad Celsius ausgehärtet, um einen positiven Abdruck zu erhalten, der letztendlich die Mikrokanäle an der Unterseite jedes Pfostens bildet.

Die dritte Komponente der Vorrichtung wird hergestellt, indem PDMS auf einem Siliziumwafer bei 500 U/min für 10 Sekunden und anschließend bei 900 U/min für 30 Sekunden aufgeschleudert wird, um eine 100 µm dicke Membran zu erzeugen. Da PDMS gasdurchlässig ist, kann Sauerstoff direkt durch diese Membran in die Mikrokanäle eingebracht werden. Nachdem alle Komponenten vorbereitet sind, wird jede Verbindungsoberfläche einer Sauerstoff-Plasmabehandlung für eine Minute unterzogen.

Verwenden Sie ein handgehaltenes Plasma-Gerät, um zunächst die sechs Mikrokanal-Komponenten an das Säulen-Array zu binden, danach bohren Sie je zwei Löcher in jede Säule, die als Gaszufuhr- und -abfluss dienen. Schließlich verbinden Sie die Membran an der Unterseite des Mikrokanals, um die Bindung zu erleichtern und eventuelle Blasen zu entfernen. Die plasmabehandelten Oberflächen werden etwa eine Minute lang mit dem abgerundeten Ende einer Pinzette zusammengedrückt; warten Sie jeweils eine Stunde zwischen den einzelnen Verbindungen, um sicherzustellen, dass das Gerät vollständig verbunden ist und kalibriert werden kann.

Nachdem ein vollständiges Gerät hergestellt wurde, muss die Sauerstoffkonzentration, die die Zellen während der Verwendung des Sauerstoffzuführ-Einsatzes in tatsächlichen Experimenten erhalten, kalibriert werden. Verwenden Sie zur Kalibrierung einen fluoreszenten Sauerstoffsensor oder eine Foxy-Slide, die eine fluoreszierende Rutheniumfarbstoffbeschichtung enthält, die durch Sauerstoff abgeschwächt wird. Foxy-Slides sind vorgeschnitten, um in den Boden einer Sechswellplatte einzupassen.

Die foxy-Abdeckung sollte so zugeschnitten werden, dass sie die Vertiefungsfläche so weit wie möglich bedeckt. Da die foxy-Abdeckung eine Dicke von etwa einem Millimeter aufweist, muss das Gerät angepasst werden, um den gewünschten Abstand für eine ausreichende Membran-Diffusion aufrechtzuerhalten.

Diese Distanz hängt vom Experiment ab, sollte jedoch in den meisten Fällen unter einem Millimeter liegen, wenn man das handgehaltene Plasma-Gerät verwendet, um eine einen Millimeter dicke Glasobjektträger-Scheibe zu schneiden. Befestigen Sie Stifte mit einer Länge von etwa sechs Millimetern und einer Breite von vier Millimetern an der Unterseite des Geräts. Das Gerät wird auf den Stiften aufliegen, die auf der geschnittenen Objektträger-Scheibe befestigt sind.

Glas-Deckgläser können ebenfalls verwendet werden, um einen Diffusionsabstand von 0,17 Millimetern für die Validierung des Sauerstoffverbrauchs zu erzielen. Geben Sie drei Milliliter deionisiertes Wasser bei Raumtemperatur in die Vertiefungen der sechslochigen Platte, in denen der Sauerstoff gemessen wird. Stellen Sie das Gerät in die Platte und wählen Sie mit der Metamorph-Software die Anzahl und Position der gewünschten Messstellen auf dem Foxy-Sensor aus.

Verschieben Sie, um Sauerstoffkonzentrationen zu messen. Schließen Sie Tai-Gun-Schläuche zwischen dem Sauerstoffflasche und der hypoxischen Insert-Vorrichtung an. Ein Präzisionsstromregler, der auf eine Durchflussrate von 50 bis 100 Milliliter pro Minute eingestellt ist, dient zur feinen Steuerung des zugeführten Gases.

Stellen Sie sicher, dass der Präzisionsströmungsregler geschlossen ist. Öffnen Sie zuerst den Regler am Tankdeckel, gefolgt vom Präzisionsregler. Verringern Sie die Durchflussrate nach 15 Minuten auf 10 bis 20 pro Minute.

Um die Bildung von Blasen im Wasser zu vermeiden, überwachen Sie den Durchflusswert während der nächsten Stunde genau und nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen vor, da sich der Druckabfall während der Gleichgewichtseinstellung des Systems verändert und sich dadurch der Durchfluss ändert, um Bilder der Platte und der Foxy-Sensoren aufzunehmen. Ein fluoreszenzfähiges Olympus IX 71-Mikroskop, eine CCD-Kamera von Q Imaging Tiga, SRV und die Bildaufnahmesoftware Metamorpho werden verwendet. Das Mikroskop ist mit einem Olympus 3 1 0 2 0 ausgestattet, einem mit Foxy kompatiblen Fluoreszenzfilter mit einer Anregungswellenlänge von 475 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 600 Nanometern.

Um die Gleichgewichtszeit und den Sauerstoffanreicherungsgrad des Geräts zu überprüfen, wählen Sie drei Messpunkte auf dem Foxy-Objektträger aus, an denen die Sauerstoffkonzentration bestimmt werden soll. Nehmen Sie unmittelbar vor Beginn des Gasflusses ein Bild des Objektträgers auf. Erfassen Sie anschließend im Abstand von jeweils 10 Sekunden Bilder über einen Zeitraum von 30 Minuten, während das Gas durch das Gerät strömt, um die räumliche Homogenität und die Sauerstoffzufuhr zu testen.

Legen Sie mehrere Punkte im Abstand von einem Millimeter über die gesamte Breite des Kanals an und messen Sie die Sauerstoffkonzentration an der Oberfläche des Wells mit Metamorph. Exportieren Sie die mittlere Bildintensität für jede Position und tragen Sie die Sauerstoffkonzentration in Abhängigkeit von der Fluoreszenzintensität auf. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie lineare Kurven an die Bereiche von 0 bis 10 % und von 10 bis 21 % anpassen, um den Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensität und Sauerstoffkonzentration darzustellen. Für jede gemessene Position können die rohen Intensitätsdaten aus Metamorph exportiert und anschließend mit Microsoft Excel oder einer anderen statistischen Software weiter analysiert werden.

Nachdem das Gerät kalibriert wurde, können Experimente wie Wundheilungsassays beginnen. Autoklavieren Sie den kalibrierten Insert bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten innerhalb von 24 Stunden vor dem Experiment und arbeiten Sie damit in einer laminarer Luftströmung gewährleistenden Zellkulturhaube, um nachfolgende Kontaminationen zu vermeiden. Tauchen Sie den sterilisierten PDMS-Insert 24 Stunden lang in serumfreies Medium ein, um Gasblasenbildung beim Einsetzen in die Plattenwells zu verhindern. Kultivieren Sie MDCK-Zellen oder andere adhärente Zellen bis zur 100 % Konfluenz in einer 6-Well-Platte und erzeugen Sie gerade Kratzer in den Zellschichten mit einer P200-Pipettenspitze. Die Kratzer simulieren Wunden in der adhärenten Zellschicht.

Entfernen Sie das Zellmedium, ohne die Zellschicht zu stören, und spülen Sie mit fünf Millilitern Medium. Aspirieren Sie erneut und füllen Sie die Vertiefungen mit drei Millilitern serumfreiem Medium auf. Setzen Sie das Gerät vorsichtig in die Platte ein, wobei Sie sicherstellen sollten, dass keine Blasen entstehen.

Das Schrägstellen des Geräts während des Einsetzens hilft, Blasen an einer Seite herauszudrücken. Achten Sie darauf, keinen übermäßigen Druck auf das Gerät auszuüben, da dies das PDMS so stark verformen könnte, dass die darunterliegenden Zellen zerquetscht werden. Stellen Sie die Platte und das Gerät auf eine beheizte Mikroskopbühne mit 37 Grad Celsius und schließen Sie die Schläuche aus der Gasquelle an die Einlass- und Auslassöffnungen des Geräts an.

Der Kulturinkubator sollte eine Öffnung aufweisen, um den Zulauf von Schläuchen zu ermöglichen, und der Schlauch sollte angeschlossen werden. Nachdem das Gerät in den Inkubator gestellt wurde, folgen Sie derselben Vorgehensweise zum Starten des Gasflusses, wie zuvor beschrieben, um zeitraffende Bilder der Zellen alle 20 Minuten über einen Zeitraum von 15 bis 18 Stunden mithilfe der zuvor beschriebenen Ausrüstung und Bildgebungssoftware aufzunehmen. Ein Algorithmus zur Messung von Wunden kann verwendet werden, um die verbleibende, nicht verheilte Oberfläche nach einer gewünschten Versuchsdauer zu analysieren. Stoppen Sie den Gasfluss, entfernen Sie die Platte und fahren Sie bei Bedarf mit der weiteren Zellverarbeitung fort. Die hypoxische Insert-Vorrichtung benötigt weniger als zwei Minuten, um sich auf 0,5 % Sauerstoff einzustellen, wie hier gezeigt.

Die Größe des Abstands zwischen Membran und Boden des Gerätes war ein entscheidender Faktor für die Effizienz der Gleichgewichtseinstellung, wobei größere Abstände mehr Zeit benötigten, um stationäre Sauerstoffkonzentrationswerte zu erreichen. Das Gerät ermöglicht außerdem eine hohe Kontrolle über die räumliche Sauerstoffversorgung in einem einzelnen Well, sodass mehrere Bedingungen erzeugt werden können und sogar ein zyklisches Sauerstoffprofil über die Oberfläche des Wells entsteht. MDCK-Zellmonolagen wurden 10 % oder 21 % Sauerstoff ausgesetzt, und die Oberfläche der Wunde wurde im Verlauf der Zeit mithilfe des MATLAB-Ts-Algorithmus zur Analyse von Scratch-Wound-Experimenten ausgewertet.

Nach 11 von insgesamt 17 Stunden verblieben 6,87 % der ursprünglichen Wunde bei einer Sauerstoffkonzentration von 10 %, während bei 21 % immer noch 64,4 % der Wunde vorhanden waren. Wie hier gezeigt, bestehen negative Korrelationen zwischen Sauerstoffkonzentrationen und offener Wundfläche für beide Sauerstoffkonzentrationen. Während der gesamten Dauer des Experiments haben wir Ihnen nun gezeigt, wie man die hypoxische Insert-Vorrichtung für einen Scratch-Wundheilungs-Assay herstellt, validiert und verwendet. Die Vorrichtung bietet gegenüber anderen Sauerstoffsystemen mehrere Vorteile, darunter eine geringere Platzbeanspruchung im Labor und eine deutlich bessere Kontrolle über die räumliche und zeitliche Sauerstoffversorgung an der Zelloberfläche.

Das Gerät kann von praktisch jedem Labor genutzt werden, das die Wirkung von Sauerstoff oder anderen Gasen wie Kohlendioxid auf Zellkulturen in vitro untersucht. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das sterilisierte Gerät und das Kulturmedium über Nacht einzuweichen, die Bildung von Blasen während des Experiments zu minimieren und das System vor Beginn des Experiments ausgleichen zu lassen.

Das liegt daran, dass sich die Durchflussrate ändert, wenn der Druck im System ausgeglichen ist. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.